本研究は、ペリン C. ボルカン (デブ 1457690) に全米科学財団からの助成金によって支えられました。

次のプロトコルは、デューク大学研究倫理委員会の倫理規範と一致。
1. 組織ショウジョウバエ蛹の発育の準備及び
<ol><li>まず、どのように多くのハエが郭清の必要があります。RT-PCR および RNAseq は、前、8 h APF、40 h APF、および大人の段階で必要である個人から 100-200 触角ディスクと触角を収集します。免疫組織の個々 の 10-20 を解剖します。</li>
	<li>郭清パッドおよび鉗子、70% のワイプを使用してを含むすべての材料をきれい江藤。切り裂かれた材料は RNA の抽出に使用する RNase 中和剤できれい、ヌクレアーゼ フリーのいずれかを使用してすべてのソリューションまたはピロ炭酸ジエチルエステル (DEPC) 処理水。 注: このプロトコルは、ガラスではなく、解離の解離のシリコン パッドを使用します。シリコン パッドは超微細鉗子にやさしい、高速かつ高品質の解離を促進します。</li>
	<li>0 h APF/前ステージで蛹を収集します。<ol>
<li>最も正確なステージングを確認するには、30 分を 1 時間間隔で幼虫を監視します。 注: やや混雑したボトルで放浪 3 齢幼虫は数時間以内は蛹可能性が高い。</li>
		<li>幼虫は不動なり非常に軽い (ほぼ白) 色蛹ケースに囲まれている、一度、小 2 で湿ったろ紙を敷いたシャーレに転送します。</li>
		<li>1-2 時間、時折監視、識別、および前蛹の転送を続けます。 注: または、すべて蛹のボトルをオフにし、幼虫は、2 h の開発を許可します。すべての蛹は、APF 範囲 2 h が 0 - 2 h になります後に収集されました。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ステップ 3.1 0 h APF ステージ前の触角を解剖するすぐに移動します。イラガ前蛹が熟成する場合は、皿にそれらを収集、カバー皿とパラフィン膜の乾燥を抑制するエッジの周りを配置し、25 ° C にペトリ皿を配置 注: 蛹は、羽化に今老化することができます。</li>
	<li>蛹は 2 h の範囲で収集の蛹がないことを確保するために 2 h 希望年齢未満の前蛹を年齢超過。</li>
	<li>組織が非常に小さく、壊れやすい、超微細鉗子 (デュモン 55) を使用します。</li>
</ol>2. 組織他のショウジョウバエの種から蛹の発達の準備及び
<ol><li>他ショウジョウバエ種の蛹の発育日数を調べるには、最適な温度でサンプルを配置、前蛹を観察するときの日付を記録、新鮮なバイアルに並べ替えたり、イラガ前蛹から成人期までの日数数を記録します。</li>
	<li>非キイロショウジョウバエ種とキイロショウジョウバエの蛹の発育のための時間の割合を記録します。キイロショウジョウバエのステージング非キイロショウジョウバエ種を年齢に時間の数を取得するために使用時間の数によって発達の時間の割合を乗算します。</li>
</ol>3.ショージョーバエ ・蛹の触角の郭清
注: すべてのエージング時間と解剖のプロトコルの説明がキイロショウジョウバエ。他のすべての種のため、種特異的な発達時期に基づく高齢化プロトコルの変更は、前述のよう、必要になります。
<ol><li>蛹の触角解剖の 50 100 0 - 2 h やヘラを使用して 6 ~ 8 h 古い蛹を収集し、郭清パッドの上に置きます。</li>
	<li>RNA 分離ソリューションの 150 μ L のピペット、RNase フリー 1.5 mL および microfuge 200 μ L ピペットを使用してチューブし、チューブを氷の場所に。</li>
	<li>1 × PBS (リン酸緩衝生理食塩水、ヌクレアーゼ フリー) の 150-200 μ L 中の蛹を解剖します。郭清パッドに PBS (液滴あたり 150-200 μ L) の複数の滴を配置します。</li>
	<li>郭清パッド PBS 滴 × 1 のいずれかで切り裂かれる 0 - 2 h または歳 6-8 h 蛹 (1 ドロップ 1 つ蛹) を配置します。体を安定させるために片方の手で鉗子を使用します。</li>
	<li>0 - 2 h 蛹、イラガ前蛹の最も前方部分 (口フック) する一方、ホールドで鉗子を用いた高齢者し、脳と前蛹の場合に添付成虫ディスクを公開するそれを引き出します。</li>
	<li>8 h APF 蛹の最初を慎重にはがし本体を囲む膜の袋内のヘッドを公開、蛹の最も前の四半期から蛹ケース。 注: ボディ、この段階でように見えます変性幼虫。</li>
	<li>ネック ジョイントの頭を削除します。 注: これにより、触角のディスクが、失われないだろうことをこの段階では主に脳の視葉に接続しています。</li>
	<li>脳と成虫ディスク組織を鉗子または 20 μ L ピペットを使用して PBS 液滴 x 別 1 に転送します。</li>
	<li>視葉で脳に接続された目触角のディスクを識別します。鉗子を使用して、脳と蛹のケースから目触角を外します。鉗子または 20 μ L ピペットを使用して PBS 液滴 x 新しい 1 に転送します。 注: 前の目触角ディスク、フラット組織です。ただし、8 h 蛹目ディスクは回転カッピング触角ディスク中央の脳の前方に座っています。</li>
	<li>鉗子を使用すると、目と触角のディスク間の接続のサイトでティッシュをカットします。20 μ L ピペットを使用して、優しく RNA 分離液試薬に切り裂かれたティッシュを転送します。できるだけ小さく量をピペットで転送される液体の量を最小限に抑えます。</li>
	<li>この操作を繰り返して、すべての蛹を解剖しました。</li>
</ol>4.ショージョーバエ ・半ば-蛹とアダルト アンテナの郭清
注: 40 h APF、変容の大部分が完了し、大人の構造、明らかになっているが、まだ白と目立たない。この発達の時点でアダルト アンテナその最終的な形をとっているけれどもまだ透明には、嗅覚受容体の少数を除いて、大半が式を開始していません。
<ol><li>蛹の触角の解剖の手順 1 で説明したように 50-100 の前蛹を収集し、25 ° C で 40 h の年齢</li>
	<li>ピペット 150 μ L の RNA 分離ソリューションに RNase フリー 1.5 mL 遠心チューブ 200 μ L ピペットを使用して、チューブを氷の場所します。</li>
	<li>郭清パッド PBS 滴 x 1 の 1 つに切り裂かれる蛹を配置します。体を安定させるために片方の手で鉗子を使用します。鉗子を使用すると、もう一方の手で、体を取り巻く膜袋内のヘッドを公開、蛹の最も前の四半期から蛹のケースを慎重にはがし。</li>
	<li>鉗子のセットが付いているボディを押し、鉗子の別のセットを持つ共同首で頭をリッピング蛹の体の残りの部分から頭を切って鉗子を使用して、慎重に。優しく鉗子を使用して PBS 液滴 x 別 1 に頭を転送します。上下のピペット ヘッド開発ショウジョウバエの頭部を囲む明確な膜を取得する (脳、等) の内容をきれいにします。 注: 40-50 h で APF、アンテナ膜の前方のセクションに接続しています。ピペッティングで頭の内容が消去されるとき、彼らは郭清の明白になります。</li>
	<li>鉗子を使用して、膜から蛹のアンテナを外します。3 からアンテナの 2ndセグメントを切断rd 3rdのセグメントだけが嗅覚受容ニューロンの家として区域の共同でスライスに鉗子を使用します。</li>
	<li>20 μ L ピペットを使用して、優しく RNA 分離液試薬に切り裂かれたティッシュを転送します。できるだけ小さく量をピペットで転送される液体の量を最小限に抑えます。この操作を繰り返して、すべての蛹を解剖しました。</li>
	<li>大人の触角解剖の約 50 大人を収集し、一週間後羽化の年齢します。 注: 嗅覚受容体遺伝子の発現と他の遺伝子はピーク羽化後一週間です。大人生体関連遺伝子検出のしきい値を超えて上昇する低豊富の成績証明書を確保するため一週間熟成します。</li>
	<li>RNA の抽出、CO2パッドの上まだ生きている間ハエを解剖します。RNase 阻害剤と CO2パッドを扱います。共焦点レーザー顕微鏡の解剖 1 × PBS または PBS + 0.2% で解剖パッドに乗って飛ぶトリトン。</li>
	<li>郭清範囲の下で CO2駅パッド上で寝る大人はまず、置きます。CO2駅パッドは、体を安定させるために片方の手で鉗子を使用して 2 番目から 3 番目の触角セグメントを優しくプル/ピンチにもう一方の手で鉗子を使用します。</li>
	<li>液体に直接アンテナを配置する鉗子を使用して RNA 分離ソリューションにアンテナを移します。この操作を繰り返して、すべての大人を解剖しました。 注: は、アンテナが RNA の分離ソリューションに沈んでいることを確認します。アンテナは、チューブの側面に残ることがあります。これは、rna の増加低下を RNA の品質と量を減らすことが生じます。</li>
	<li>直接 RNA の抽出に進むか、長期保存のための-80 ° c チューブを配置します。</li>
</ol>5 切り裂かれたティッシュから RNA の隔離
<ol><li>-80 ° C の記憶域からすべてのサンプルを削除し、氷の上にそれらを解凍します。</li>
	<li>簡単にスピン (5-6 s, ~ 6,000 x g) 各サンプル チューブの下部に資料の収集をします。</li>
	<li>10 のオートクレーブ養生プラスチック杵と電気モーターを使用して各サンプルを挽く氷上 s。</li>
	<li>5.2 と 5.3 の 4 の手順を繰り返します。</li>
	<li>市販のキットを使用して、次の最適な収率の製造元のプロトコル、RNA の抽出を実行します。</li>
	<li>市販試薬、遺伝子興味のそして次の製造元のプロトコルに対して特異的プライマーを用いた qRT PCR を実行します。<ol>
<li>次の条件を使用してすべての PCR 反応を行う: 95 ° C 10 分の変性に続いて 40 サイクル 95 ° C の 15 s、55 ° C、30 s、および 30 ° C、60 s。 注:ディップとdprの遺伝子のプライマーは、表 1に記載されて、嗅覚受容体遺伝子のプライマーは、Hueston CEらに表示されます。8。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 蛹触角ディスクと免疫組織化学のアンテナの固定
注: は、10-20 個人、組織、時間の同じ量の修正の確認からバッチで組織を修正します。サンプルは、組織の完全性を最大化する定着剤にそれらを転送する前に PBT (洗剤で PBS) で滞在時間の量を最小限に抑えます。
<ol><li>収集切り裂かれた触角ディスクまたは 0.2% の 200 μ L を含む 200 μ L の PCR チューブに蛹のアンテナ PBT 氷の上、組織の整合性を維持し、200 μ L の PCR の壁に付着してからサンプルを避けるためには不完全な固定につながる管します。 注: 蛹触角と触角ディスクかなり半透明を参照してくださいすることは困難にすることができます。組織の損失を防ぐためにすべての洗浄のステップの郭清範囲を使用することをお勧めします。また、96-well テラサキ プレート固定用に使用されると最適組織に管理する染色があります。</li>
	<li>4% の約 200 μ L で蛹から解剖の触角と触角のサンプルを修正 PFA (パラホルムアルデヒド) 室温で 30 分間。これおよびそれに続く手順は正しくソリューションのサンプルを混ぜて nutator にサンプル チューブを維持します。6.7 のステップに進みます。</li>
	<li>アダルト アンテナ頭全体をまず解剖 4% の約 200 μ L でそれを修正、PFA (パラホルムアルデヒド) 室温で 1 時間。</li>
	<li>0.2% の 200 μ L で 3 x を洗って 10 分 PBT です。孵化の間に、nutator のサンプルを保ちます。</li>
	<li>固定ヘッドからの第 2 触角セグメントの細かい解剖の解剖顕微鏡へ戻る。頭を安定させる、2 番目から 3 番目の触角セグメントを優しくプル/ピンチに鉗子を使用してください。</li>
	<li>4% の約 200 μ L に切り裂かれた第 3 触角セグメントを移す PFA (パラホルムアルデヒド) し、室温で 30 分間それらを修正します。</li>
	<li>0.2% の 200 μ L で 3 x を洗って 10 分 PBT です。孵化の間に、nutator のサンプルを保ちます。</li>
	<li>4 ° C で試料を保存か全体マウント免疫組織化学的に直接進みます。 注: 抗体が使用されていると、染色の効率が変わります。このメソッドは、以下の豊富なタンパク質タグの適切なまたは弱い抗体をする必要があります。しかし、時に、それは (アイデンティティまたは固定液の量や固定の時間) プロトコルの最適化を必要があります。</li>
</ol>

<ol>
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この議定書は遺伝子と転写プログラム開発ショウジョウバエ嗅覚組織だけでなく、これらのプログラムの比較分析ショウジョウバエで動作を識別するのに興味を持って実験室のための有用なリソース種。それは、将来の研究のためのプライマーとしてさまざまな発達段階からシステム レベルの転写プロファイルが必要な場合に便利です。ここで説明されているプロトコルはステ...

発達神経生物学、システム神経科学、神経生理学、行動学、行動の進化1,2,3、ショウジョウバエの嗅覚システムは広く使用されているシステム 4。ショウジョウバエ嗅覚組織の水力発電と熱感覚ニューロン1,5,6に加えて揮発性化学手掛かりを検出嗅覚受容神経細胞 (ORNs) 家します。この原稿の全体的な目標は、ステージおよびショウジョウバエ種の蛹と大人の嗅覚組織の開発を分析する方法を示すことです。この技術のための理論的根拠は体内組織ラベリング技術にさらに RNAseq、定量的 RT-PCR など、周辺の嗅覚システムの分子・発達的分析に蛹の段階からサンプルを生成するには.この手法は、特定型のセルのすべての遺伝子導入試薬を持っていない非キイロショウジョウバエ ショウジョウバエの種から開発大人嗅覚システムの転写プロファイルのダイナミクスを識別する特に役立ちますラベリングと分析。本稿では、触角のディスクと蛹と大人のショウジョウバエ種からアンテナを分析する方法を示します。まず、ショウジョウバエの蛹殻形成過程 (APF、白い蛹や前蛹) 発達のステージングと種特異的な高齢化のための 0 h を識別する方法を示します。次に、触角ディスクと 3 番目の触角セグメントを分析する方法を示す具体的には、目のディスクと RNAseq または RT-Pcr に必要な組織の純度の第 2 触角セグメントからそれらを分離する方法。キイロショウジョウバエ約このプロトコルで記述されている段階対応済みパターンの触角 (前蛹)、前駆体、触角からの選択ディスク (8 h APF) ORNs (40 h APF) の分化の開始とアダルト アンテナ。メソッドを使用して分離された大人アンテナからと生体内での免疫組織化学の最後に、我々 は、定量的 RT-PCR 法の例を与えます。このメソッドは、RNA ・ DNA 分析、ショウジョウバエ種から末梢の嗅覚組織の開発に免疫組織化学のサンプルを生成する使用できます。

<table><tbody><tr><td>10X Phosphate-buffered Saline</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td>Dilute to 1X in RNase free water</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;tank</td><td>Air Gas</td><td>CD R200</td><td></td></tr><tr><td>Two sharp forceps (Dumont #55)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>RNA isolation solutions</td></tr><tr><td>Dissecting Microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Small bucket with ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P20 and P200 micropipettes and tips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL Microfuge tubes</td><td></td><td></td><td>Purchase nuclease free for best results</td></tr><tr><td>0.2 mL PCR tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde powder</td><td>Polysciences</td><td>380</td><td></td></tr><tr><td>10% Triton X-100</td><td>Teknova</td><td>T1105</td><td>Dilute to 0.2% v/v in 1X PBS</td></tr><tr><td>2&quot; petri dishes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>55mm filter paper</td><td>Whatman</td><td>1001-055</td><td>Wet with water and place in a petri dish to keep pupae moist</td></tr><tr><td>25 C incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>deionized H2O</td><td></td><td></td><td>Purchase nuclease free or treat with DEPC</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>to be used for making dissection pads from Terizaki plate covers.</td></tr><tr><td>MicroWell Mini Trays with lids</td><td>Nunc</td><td>438733</td><td>Lids can be used to make silicone dissection pads</td></tr><tr><td>Rabbit anti-GFP antibody</td><td>MBL international corpor</td><td>PM005</td><td>primary antibody</td></tr><tr><td>Mouse anti RAT CD2</td><td>AbD seroTec</td><td>MCA154RHDL</td><td>primary antibody</td></tr><tr><td>ADL195 (anti lamin, mouse)</td><td>Dev studies hydoma ban</td><td>ADL195-s</td><td>primary antibody</td></tr><tr><td>Alexa Fluor&amp;reg; 488 goat anti-rabbit IgG (H+L)</td><td>invitrogen</td><td>A11008</td><td>Secondary antibody</td></tr><tr><td>Cy3 Goat Anti-Mouse IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-166-003</td><td>Secondary antibody</td></tr><tr><td>Triton X-100, Protein Grade Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered</td><td>CALBIOCHEM</td><td>648463</td><td>detergent</td></tr><tr><td>Lab Rotator</td><td>Thermo scientific</td><td></td><td>Rotator</td></tr><tr><td>Nuclease Free Water</td><td>Growcells.com</td><td>NUPW-0125</td><td>Water</td></tr><tr><td>Light-Duty Tissue Wipers</td><td>VWR</td><td>82003-822</td><td>For cleaning dissection supplies</td></tr><tr><td>Superscript II</td><td>invitrogen</td><td>18064014</td><td>Reverse Transcriptase&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>QIAshredder (50)</td><td>RNA extraction</td><td>QIAGEN</td><td>79654</td></tr><tr><td>Oligo(dT)12-18 Primer</td><td>RT</td><td>life technologies</td><td>18418012</td></tr><tr><td>RNeasy MinElute Cleanup Kit (50)</td><td>RNA extraction</td><td>QIAGEN</td><td>74204</td></tr><tr><td>FASTSTART UNIV SG MASTER (5 ML)(500 RXN)</td><td>qPCR</td><td>Roche</td><td>04913850001</td></tr><tr><td>FASTSTART ESSENTIAL GREEN DNA MASTER&amp;nbsp;</td><td>qPCR</td><td>Roche</td><td>06402712001</td></tr><tr><td>LIGHTCYCLER 480 - MULTIWELL PLATE 96</td><td>qPCR</td><td>Roche</td><td>04729692001</td></tr><tr><td>NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix</td><td>qPCR</td><td>NEB</td><td>M0541S</td></tr></tbody></table>

preparing developing peripheral olfactory tissue for molecular and immunohistochemical analysis in drosophila

ショウジョウバエの嗅覚は発達神経生物学、システム神経科学、神経生理学、行動、行動の進化で広く使われているシステムです。ショウジョウバエ嗅覚組織の水力発電と熱感覚ニューロンに加え揮発性化学手掛かりを検出嗅覚受容神経細胞 (ORNs) 家します。このプロトコルでは大人のショウジョウバエ種の嗅覚の末梢組織の開発の解剖について述べる。最初にステージングして、半ば蛹と大人からアンテナの解剖によって続いて蛹初期から続く、触角の解剖によってショウジョウバエ幼虫の年齢方法について述べる。我々 も準備を qRT PCR、RNAseq、または免疫組織化学の RNA の抽出など、分子生物学の手法で活用できるメソッドに示します。これらのメソッドは、種特異的な蛹の発育度の決定、および適切な高齢化の各段階の計算後、他のショウジョウバエの種に適用もできます。

切り裂かれた発展途上の嗅覚組織遺伝子発現を評価する RT-PCR による RNA 抽出の使用ことができますまたはその表現パターンとの遺伝子の細胞内の局在を決定する免疫プロトコルによって取ることができます。関心します。このセクションのいずれかのプロトコルからの代表的な結果を提案する.図 1は、代表定量的 RT-PCR 野生型アダルト アンテナ...

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Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

ここでは、ステージし、解剖ショウジョウバエ種から嗅覚の組織を開発するためのプロトコルを提案する.解剖組織は、免疫組織化学または上皮内などの生体内解析だけでなく、定量的 RT-PCR (逆転写ポリメラーゼ連鎖反応) や RNA 配列 (RNAseq) などの分子生物学的解析の後で使用できます。交配。

周辺嗅覚組織の開発を準備する分子とショウジョウバエの免疫組織化学的解析

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and ...

preparing-developing-peripheral-olfactory-tissue-for-molecular

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

5.7K ビュー.  Duke University. ここでは、ステージし、解剖ショウジョウバエ種から嗅覚の組織を開発するためのプロトコルを提案する.解剖組織は、免疫組織化学または上皮内などの生体内解析だけでなく、定量的 RT-PCR (逆転写ポリメラーゼ連鎖反応) や RNA 配列 (RNAseq) などの分子生物学的解析の後で使用できます。交配。

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Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila

Cells display different morphologies and complex anatomical relationships. How do cells interact with their neighbors? Do the interactions differ between cell types or even within a given type? What kinds of spatial rules do they follow? The answers to such fundamental questions in vivo have been hampered so far by a lack of tools for high resolution single cell labeling. Here, a detailed protocol to target single cells with a MultiColor FlpOut (MCFO) technique is provided. This method relies on three differently tagged reporters (HA, FLAG and V5) under UAS control that are kept silent by a transcriptional terminator flanked by two FRT sites (FRT-stop-FRT). A heat shock pulse induces the expression of a heat shock-induced Flp recombinase, which randomly removes the FRT-stop-FRT cassettes in individual cells: expression occurs only in cells that also express a GAL4 driver. This leads to an array of differently colored cells of a given cell type that allows the visualization of individual cell morphologies at high resolution. As an example, the MCFO technique can be combined with specific glial GAL4 drivers to visualize the morphologies of the different glial subtypes in the adult Drosophila brain.

Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila

Cells display different morphologies and establish a variety of interactions with their neighbors. This protocol describes how to reveal the morphology of single cells and to investigate cell-cell interaction by using the well-established Gal4/UAS expression system.

多色 FlpOut 技術の高分解能単一細胞の形態とショウジョウバエにおけるグリア細胞の細胞間相互作用の研究への応用

Cells display different morphologies and complex anatomical relationships. How do cells interact with their neighbors? Do the interactions differ between ...

行動学

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

発生生物学

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a reliable protocol for the dissection of the delicate Drosophila pupal retina. Our surgical approach utilizes readily-available microdissection tools to open pupae and precisely extract eye-brain complexes. These can be fixed, subjected to immunohistochemistry, and retinas then mounted onto microscope slides and imaged if the goal is to detect cellular or subcellular structures. Alternatively, unfixed retinas can be isolated from brain tissue, lysed in appropriate buffers and utilized for protein gel electrophoresis or mRNA extraction (to assess protein or gene expression, respectively). Significant practice and patience may be required to master the microdissection protocol described, but once mastered, the protocol enables relatively quick isolation of mainly undamaged retinas.

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

This paper presents a surgical method for dissecting Drosophila pupal retinas along with protocols for the processing of tissue for immunohistochemistry, western analysis, and RNA-extraction.&#160;

免疫組織化学、西部の分析、および RNA の隔離のためのショウジョウバエ蛹網膜の解剖

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

における嗅覚受容ニューロンのホールマウント免疫標識<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;アンテナ

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

神経科学

An Explant System for Time-Lapse Imaging Studies of Olfactory Circuit Assembly in Drosophila

~Neurons are precisely interconnected to form circuits essential for the proper function of the brain. The Drosophila olfactory system provides an excellent model to investigate this process since 50 types of olfactory receptor neurons (ORNs) from the antennae and maxillary palps project their axons to 50 identifiable glomeruli in the antennal lobe and form synaptic connections with dendrites from 50 types of second-order projection neurons (PNs). Previous studies mainly focused on identifying important molecules that regulate the precise targeting in the olfactory circuit using fixed tissues. Here, an antennae-brain explant system that recapitulates key developmental milestones of olfactory circuit assembly in culture is described. Through dissecting the external cuticle and cleaning opaque fat bodies covering the developing pupal brain, high quality images of single neurons from live brains can be collected using two-photon microscopy. This allows time-lapse imaging of single ORN axon targeting from live tissue. This approach will help reveal important cell biological contexts and functions of previously identified important genes and identify mechanisms underpinning the dynamic process of circuit assembly.

An Explant System for Time-Lapse Imaging Studies of Olfactory Circuit Assembly in Drosophila

This protocol describes the dissection procedure, culture condition, and live imaging of an antennae-brain explant system for the study of the olfactory circuit assembly.

ショウジョウバエの嗅覚回路アセンブリのタイムラプスイメージング研究のための外植システム

~Neurons are precisely interconnected to form circuits essential for the proper function of the brain. The Drosophila olfactory system provides an ...

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a plethora of mutant strains and technical tricks have been developed to allow sophisticated questions to be asked and answered in a reasonable amount of time. Fundamental insight into the interplay of components of all known major signaling pathways has been obtained in forward and reverse genetic Drosophila studies. The fly eye has proven to be exceptionally well suited for mutational analysis, since, under laboratory conditions, flies can survive without functional eyes. Furthermore, the surface of the insect eye is composed of some 800 individual unit eyes (facets or ommatidia) that form a regular, smooth surface when looked at under a dissecting microscope. Thus, it is easy to see whether a mutation might affect eye development or growth by externally looking for the loss of the smooth surface ('rough eye' phenotype; Fig. 1) or overall eye size, respectively (for examples of screens based on external eye morphology see e.g.1). Subsequent detailed analyses of eye phenotypes require fixation, plastic embedding and thin-sectioning of adult eyes.
The Drosophila eye develops from the so-called eye imaginal disc, a bag of epithelial cells that proliferate and differentiate during larval and pupal stages (for review see e.g. 2). Each ommatidium consists of 20 cells, including eight photoreceptors (PR or R-cells; Fig. 2), four lens-secreting cone cells, pigment cells ('hexagon' around R-cell cluster) and a bristle. The photoreceptors of each ommatidium, most easily identified by their light sensitive organelles, the rhabdomeres, are organized in a trapezoid made up of the six "outer" (R1-6) and two "inner" photoreceptors (R7/8; R8 [Fig. 2] is underneath R7 and thus only seen in sections from deeper areas of the eye). The trapezoid of each facet is precisely aligned with those of its neighbors and the overall anteroposterior and dorsoventral axes of the eye (Fig. 3A). In particular, the ommatidia of the dorsal and ventral (black and red arrows, respectively) halves of the eye are mirror images of each other and correspond to two chiral forms established during planar cell polarity signaling (for review see e.g. 3).
The method to generate semi-thin eye sections (such as those presented in Fig. 3) described here is slightly modified from the one originally described by Tomlinson and Ready4. It allows the morphological analysis of all cells except for the transparent cone cells. In addition, the pigment of R-cells (blue arrowheads in Fig. 2 and 3) can be used as a cell-autonomous marker for the genotype of a R-cell, thus genetic requirements of genes in a subset of R-cells can readily be determined5,6.

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

A standard approach to prepare adult Drosophila eyes for semi-thin sectioning and light microscopic analysis is presented here. The protocol can be used for gross morphological analysis of eye defects, or with the indicated adjustments can be used to determine genetic requirements of genes in specific cell types of the eye (e.g. clonal analysis of photoreceptors) or for electron microscopic analysis.

大人の準備ショウジョウバエ</emシンセクショニングおよび顕微鏡分析のための>アイズ

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a ...

生物学

Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

Insects rely on their sense of smell to guide a wide range of behaviors that are critical for their survival, such as food-seeking, predator avoidance, oviposition, and mating. Myriad chemicals of varying volatilities have been identified as natural odorants that activate insect Olfactory Receptor Neurons (ORNs). However, studying the olfactory responses to low-volatility odorants has been hampered by an inability to effectively present such stimuli using conventional odor-delivery methods. Here, we describe a procedure that permits the effective presentation of low-volatility odorants for in vivo Single-Sensillum Recording (SSR). By minimizing the distance between the odor source and the target tissue, this method allows for the application of biologically salient but hitherto inaccessible odorants, including palmitoleic acid, a stimulatory pheromone with a demonstrated effect on ORNs involved in courtship and mating behavior1. Our procedure thus affords a new avenue to assay a host of low-volatility odorants for the study of insect olfaction and pheromone communication.

Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

The overall goal of this protocol is to demonstrate how to present odorants of low volatility for single-sensillum recording from Drosophila olfactory receptor neurons that respond to long-chain cuticular pheromones.

からの電気生理学的記録<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;低揮発性の臭気物質に対するトリコイドセンシラ

Insects rely on their sense of smell to guide a wide range of behaviors that are critical for their survival, such as food-seeking, predator avoidance, ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. Drosophila larval neuronal dendritic arborization (da) is an ideal model for studying morphogenesis of neural dendrites and gene function in the development of nervous system. There are four classes of da neurons. Class IV is the most complex with a branching pattern that covers almost the entire area of the larval body wall. We have previously characterized the effect of silencing the Drosophila ortholog of SOX5 on class IV neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) using four parameters: the length of dendrites, the surface area of dendrite coverage, the total number of branches, and the branching structure. This protocol presents the workflow of NDAC quantitative analysis, consisting of larval dissection, confocal microscopy, and image analysis procedures using ImageJ software. Further insight into da neuronal development and its underlying mechanisms will improve the understanding of neuronal function and provide clues about the fundamental causes of neurological and neurodevelopmental disorders.

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

This protocol focuses on quantitative analysis of neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) in Drosophila, which can be used for studies of dendritic morphogenesis.

ショウジョウバエのニューロン樹状分枝複雑さの定量解析

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...

<meta charset="utf8"></head><body>ショウジョウバエの若年脳における嗅覚体験誘発性シナプスリモデリング

Experience-Dependent Remodeling of Juvenile Brain Olfactory Sensory Neuron Synaptic Connectivity in an Early-Life Critical Period

Early-life olfactory sensory experience induces dramatic synaptic glomeruli remodeling in the Drosophila juvenile brain, which is experientially dose-dependent, temporally restricted, and transiently reversible only in a short, well-defined critical period. The directionality of brain circuit synaptic connectivity remodeling is determined by the specific odorant acting on the respondent receptor class of olfactory sensory neurons. In general, each neuron class expresses only a single odorant receptor and innervates a single olfactory synaptic glomerulus. In the Drosophila genetic model, the full array of olfactory glomeruli has been precisely mapped by odorant responsiveness and behavioral output. Ethyl butyrate (EB) odorant activates Or42a receptor neurons innervating the VM7 glomerulus. During the early-life critical period, EB experience drives dose-dependent synapse elimination in the Or42a olfactory sensory neurons. Timed periods of dosed EB odorant exposure allow investigation of experience-dependent circuit connectivity pruning in juvenile brain. Confocal microscopy imaging of antennal lobe synaptic glomeruli is done with Or42a receptor-driven transgenic markers that provide quantification of synapse number and innervation volume. The sophisticated Drosophila genetic toolkit enables the systematic dissection of the cellular and molecular mechanisms mediating brain circuit remodeling.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:臨界期の経験依存性シナプス刈り込みにおけるグリアの影響の調査

We describe here methods for inducing and analyzing olfactory experience-dependent remodeling of antennal lobe synaptic glomeruli in the Drosophila juvenile brain.

周辺嗅覚組織の開発を準備する分子とショウジョウバエの免疫組織化学的解析

要約

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多色 FlpOut 技術の高分解能単一細胞の形態とショウジョウバエにおけるグリア細胞の細胞間相互作用の研究への応用

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

免疫組織化学、西部の分析、および RNA の隔離のためのショウジョウバエ蛹網膜の解剖

における嗅覚受容ニューロンのホールマウント免疫標識

ショウジョウバエの嗅覚回路アセンブリのタイムラプスイメージング研究のための外植システム

大人の準備ショウジョウバエアイズ

からの電気生理学的記録

ショウジョウバエのニューロン樹状分枝複雑さの定量解析

若年脳嗅覚神経細胞シナプス結合性の経験依存的リモデリング

若年脳嗅覚神経細胞シナプス結合性の経験依存的リモデリング