このプロトコルは、画像を生き、発達中の脳から単一の軸索レベルで嗅覚回路アセンブリを飛ばす方法を提示する。発達中の脳を覆っている組織をきれいに解剖し、脳内部から高画質な画像を収集することができます。この方法は、回路開発の細胞生物学的基盤に関する貴重な洞察を提供します。
他の回路の開発を研究するためにも簡単に変更できます。人が微小解剖で安定した手の制御を行うには時間がかかります。より多くの練習が役立ちます。
まず、厚さ0.5センチのシルガードをシャーレの底面に敷き詰め、室温で48時間養生させることで、タイムラプスイメージング中に外植体を動員するための培養皿を準備します。このプレートに鉗子を使って外植体を固定するためのマイクロピンを用意するには、鋭利な端を片側に揃えたテープに複数のマイクロピンを貼り付け、はさみで2ミリの鋭利な端を切ります。次に、鉗子を使用して、切断したマイクロピンを既製のシルガードプレートのシルガード層に挿入する。
ブラシを使用して、1時間以内に蛹を形成する白い蛹を集め、それらを新しいバイアルに移す。蛹を摂氏37度で調温した水浴中で40分間インキュベートし、ランダム型からまばらなORNクローンを誘導する。ヒートショック後、バイアルを摂氏25度で30時間置き、蛹形成後30時間で蛹を老化させる。
次に、本文原稿に記載されているように外植用の培地を準備し、摂氏4度で保存する。イメージング当日、ウシ胎児血清、ヒトインスリンストック溶液、および20ヒドロキシエクジソンストック溶液をエタノールに溶解し、45ミリリットルのシュナイダーショウジョウバエ培地を含む50ミリリットルのバイアルに加える。よく混ぜて、15ミリリットルのフル培地を新しい50ミリリットルの円錐形チューブに移し、残りのフル培地を摂氏4度で1週間保存します。
次いで、完全な培地を含むチューブ開口部をパラフィンフィルムで覆い、滅菌された5ミリリットルのピペットチップを通して液面下の酸素気泡を毎秒1個の気泡の速度で20〜30分間ポンピングすることによって培地を酸素化する。次に、解剖井戸表面を滅菌し、予め用意しておいたシルガードプレートを70%エタノールで乾燥させてから使用してください。ブラシを使用して、APF蛹をティッシュペーパーに30時間移し、蛹の外面を5分間乾燥させる。
スライドガラスに両面テープを貼った後、乾燥した蛹を背側が上を向くようにテープの粘着面に丁寧に貼り付けた。蛹をブラシで優しく押して、蛹を傷つけることなく腹側をテープに正しく取り付けます。茶色の蛹ケースと蛹の間に鉗子の鋭い先端を横から挿入し、蛹の後端までの線を通して茶色の蛹ケースを慎重に壊します。
茶色の蛹のケースが開いたら、鉗子を使用して、蛹を静かに保持し、1ミリリットルの酸素化された完全な媒体を含む解剖井戸に移す。蛹を培地に浸して井戸の底に沈める。アンテナ脳外植体を蛹から解剖するには、片手で鉗子と一対のマイクロハサミを使用して蛹を優しく保持し、蛹の後側から小さな穴を作り、蛹の内部に高圧を放出します。
穴から始めて、腹側の正中線を通って首まで切り取り、次に首の円周を切り開いて頭を蛹の体から切り離し、体を別の井戸に置きます。次に、脳の背側を覆う透明なキューティクルをカットして脳の上の脂肪体を露出させ、網膜とアンテナが取り付けられているキューティクルを保持するようにし、同様に脳の腹側からキューティクルをカットします。P10ピペットを用いて頭部の背側および腹側の開放領域に向けて培地をピペットし、脳およびアンテナを覆う脂肪体を穏やかに洗い流す。
両側ORN軸索またはORN軸索とPN樹状突起ターゲティングとの相互作用を研究するには、キューティクルと脳の間にマイクロハサミの刃を慎重に配置し、関心のある触角神経を切断することによって、ステージ中に触角神経を切断する。解剖した外植体をシルガードプレートに移すために、約200マイクロリットルの酸素化された完全培地の液滴をシルガード表面に置く。解剖した体幹に由来する脂肪体を数回ピペットは、内面をコーティングするための200マイクロリットルのピペットチップを介して、解剖ウェルからシルガードプレート上の培地液滴への移送中に外植体がピペットチップに付着するのを防止する。
鉗子を使用して外植体を2つの光学ローブのシルガード層に固定し、シルガードプレートをイメージングステーションに慎重に置き、プレートをテープで固定し、P1000ピペットを使用して酸素化されたフル培地10ミリリットルをシルガードプレートにゆっくりと加えます。ORN軸索は、APFで18時間から36時間の間に触角葉に到着し、その後、触角葉をナビゲートし、正中線を横切り、糸球体を革新する。登録前は、脳が発達するにつれて軸索はいくらかの横方向の漂流を示し、登録後、漂流は矯正された。
抽出されたORN軸索の糸球体同一性は、ニューロピルマーカーおよびカドヘリンの免疫染色によって明らかにされた。内部ローブマップと比較することにより、各糸球体の同一性を決定することができた。エクスビボ培養の間、細菌の増殖は、通常、嗅覚回路の休止発達を引き起こす。
そのため、イメージング前に文化的な皿やピンを徹底的に滅菌し、イメージングルームを清潔で隔離しておくことが重要です。より高い空間時間分解能を達成するために、この外植系は、より高度な顕微鏡、適応光学格子光学顕微鏡を用いて画像化することができる。ここでは工場回路の開発を例に挙げて示したが、このシステムは、発達中の中枢脳における他の回路や発達過程の研究にも拡張できる可能性がある。
