この方法は、骨髄異形成症候群や骨髄細胞系統における成熟異常と共に進化する他の造尿疾患などの骨髄疾患の診断における重要な質問に答える助けとなる。この手法の主な利点は、その分析と解釈における研究者の主観性を低下させる点である。この方法は、骨髄異形成の最も差別的なパラメータを示す洞察を提供することができます。
これは、通常の骨髄細胞集団との差を定量化することができます。手順を実証することは、私たちの研究室の博士研究員であるティファニー・ピコットです。15ミリリットルの円錐管に10ミリリットルの洗浄バッファーを含む10ミリリットルの洗浄バッファーと1本の洗浄バッファーの600マイクロリットルと、洗浄ごとに10ミリリットルの新鮮な洗浄バッファーを混合することから始めます。
2回目の洗浄後、ペレットを400マイクロリットルの新鮮な洗浄バッファーで再懸濁し、350マイクロリットルの細胞懸濁液を5ミリリットルのポリプロピレンFACSチューブに移し、パネル全体のバックボーン抗体を含む。細胞を十分に混合した後、ピペット等量の細胞抗体溶液を3つの新しいポリプロピレンチューブに入れ、必要に応じて各チューブの最終体積を200マイクロリットルまで新鮮な洗浄バッファーで持ち込みます。次に、目的の細胞表面マーカーに対して適切な量の抗体を混合して添加し、室温で30分間インキュベーションを行い、光から保護する。
インキュベーションの終わりに、混合して2ミリリットルの溶解溶液を加え、室温で10分間インキュベーションし、光から保護します。遠心分離によって細胞を採取し、ペレットを邪魔することなく、各チューブに最後の50マイクロリットルの上澄み物を除いてすべてを捨てます。残りの上清中のペレットを緩やかに混合して再中断し、各サンプルに新鮮な洗浄バッファーを2ミリリットル加えます。
2回目の洗浄後、上清を捨てて、各チューブに約50マイクロリットルの残留体積を残し、ペレットを乱さずに放置する。すぐに分析するために、混合してPBSの200マイクロリットルでペレットを再懸濁します。フローサイトメーターでサンプルを読み取るために、まずフローサイトメーターソフトウェアで新しい実験を開き、名前、サンプルの種類、日付に従って実験の名前を変更します。
3つのチューブに新しい標本を作成し、実験レイアウトの各チューブで使用する抗体を指定します。サイトメーターの設定を開き、アプリケーション設定を選択して、月次設定で取得した値を適用します。新しいグローバルワークシートを開き、単一細胞を腺球状、単球、爆風、リンパ球の集団に合わせて適切なドットプロットを作成します。
報酬コントロール用の新しいグローバル ワークシートを作成します。次に、各チューブから500,000個のイベントを取得し、中程度の取得率で、その技術的検証後にfcs 3.0ファイルとしてデータをエクスポートする。新しい分析を開始する前に、好中球、単球、有核赤線系分、および分析ファイルを inp 形式で、正常骨髄データを含む cyt ファイルをダウンロードします。
次に、データをデスクトップに保存します。好中球の成熟をデータベースに保存するために、まずInfinicytソフトウェアを開き、次に好中球の成熟データに対応するcytファイルを開きます。APS グラフに成熟経路を描画し、好中球の成熟経路をデータベースに保存します。
解析する必要がある好中球系統成熟の fcs ファイルを開きます。プロファイルタブから好中球成熟 inp ファイルをアップロードします。この系統の分析は3つのステップに分かれています。
CD34陽性、好中球をコミットした爆風の選択から始めます。この目的のために、7つのゲートの交点を使用して、CD34陽性、CD117陽性、HLADR低、CD10陰性、CD13陽性、CD11 b-陰性事象の選択を可能にする。CD117陽性、CD34陰性好中球前駆体の選択で分析を続ける。
より成熟した好中球細胞の選択で分析を続ける。次に、単球系線細胞の解析を示す。APS グラフに成熟経路を描画します。
成熟感を示す矢印が未熟、単球細胞、CD14陰性、IREM2陰性、成熟単球、CD14陽性、IREM2陽性に向かっていることを確認する。単球系の成熟経路をデータベースに保存します。解析する必要がある単球系の成熟のために fcs ファイルを開きます。
単球系分分析のプロファイルをアップロードします。単球系の細胞を同定するために、CD64陽性高、CD117陽性、CD117陰性、HLADR陽性事象の選択を可能にする4つのゲートの交点を使用する。これらのイベントを、人口階層ツリーの単球タブに割り当てます。
NRC データベースに保存する必要がある NRC cyt ファイルを開きます。APS グラフに成熟経路を描画し、核となる赤細胞の成熟経路をデータベースに保存します。解析する必要がある fcs ファイルを開きます。
有核赤細胞の分析のテンプレートをプロファイルからアップロードします。この系統の解析は2つのステップに分かれています。CD34陽性の選択から始まり、エリスロイドは爆発を犯した。
ここでは、7つのゲートの交点を使用して、CD34陽性、CD117陽性、HLADR低、CD105陽性、CD33陽性、CD36陽性、CD71陽性事象の選択を可能にする。これらのイベントを母集団階層の NRC タブに割り当てます。CD34陽性エリスロイドが爆発を確認できないように取り除きます。
より成熟したエリスロイド細胞を同定するには、CD45陰性とCD45陽性低、サイドスキャッタ低、CD36陽性高、CD71陽性高の判別を可能にする4つのゲートの交点を使用する。次に、CD36ハイサイド散乱低血小板を有核赤血球から取り出し、この集団をNRCタブに割り当てる。骨髄区画における骨髄腫成熟を評価するために、評価する必要がある場合から目的の系統に対応するcytファイルを開く。
母集団階層ツリーの中等球のタブに割り当てられたイベントのみを表示します。APSグラフに成熟経路を描画し、正常骨髄で好中球の成熟に対応するデータベースをロードし、データを比較します。データが少なくとも部分的に互換性がある場合、ソフトウェアは正規化された成熟差分図とパラメータバンドを作成して成熟の違いを視覚化します。
骨髄区画における単球成熟を比較するために、単球データベースを含む正常な骨マローからのデータを持つ新しいケースについて、単球系に対応するcytファイルを開く。母集団階層ツリーの単球タブに割り当てられたイベントのみを表示し、APS グラフに成熟経路を描画します。通常の骨マローで単球成熟に対応するデータベースをロードし、データを比較します。
骨髄区画中の有核赤細胞成熟を比較するために、新しい症例に対して、正常な骨髄からのデータをNRCデータベースに含めて、NRCの系統に対応するcytファイルを開く。母集団階層ツリーの NRC タブに割り当てられたイベントのみを表示します。そして、APSグラフに成熟経路を描きます。
正常な骨髄でNRC成熟に対応するデータベースをロードし、データを比較します。次に、新しいファイルとデータベースに含まれるデータの差の有意性を視覚化するために、[正規化された成熟の差] をクリックしてズームします。フロー サイトメトリクス データ分析で階層分類アルゴリズムを使用するメソッドは、セルの母集団の重複にカウントされないため、主観的で本質的に不正確であることを覚えておいてください。
骨髄系正常成熟データベースに対してMDSであると疑われるサイトペニアの新しい症例の評価により、細胞学的または細胞原性異常のない場合であっても、好中球、単球、およびNRC系統の異常発現成熟抗原の同定が可能になる。この手順を試みる間、フローサイトメトリックデータを標準化された方法で取得し、毎月のサイトメーター設定設定、毎日のチェック、使用前に抗体を厳密にピペットにし、染色時間を尊重することを忘れないでください。この手順に従って、コンパスのような別のメソッドを実行して、異なるケースグループを比較し、特定のケースグループの最終的なタイピック刻印など、追加の質問に答えることができます。
その開発後、この技術は、不確定な可能性のクローン造形の場合、異形成プロセスに確実に関連する最終的なタイプの変化を特定するために、骨髄細胞成熟パターンを探求することに興味を持つ研究者のための道を開いた。健全なドナーからのデータの数を増やしてデータベースを更新すると、分析の堅牢性が向上する可能性があることに注意してください。
