この技術を用いて生成されたデータは、一般的な抗体または抗体の生命療法に使用することができる自己免疫性の高いマウスモデル、ならびにヒト化マウスの理解を促進する。蛍光体の拡大範囲を持つ試薬の可用性は、個々の細胞上の複数のパラメータの同時分析を可能にし、B細胞の不均一性の評価を可能にする。このプロトコルは、遺伝子操作されたマウスのフェノタイピングを目的として開発されました。
遺伝子操作がB細胞の発達を変えるかどうか判断する。こんにちは、私はフェイスハリスです。私は今日、手順をデモンストレーションします。
各動物から各細胞タイプの100万個を96ウェルU-底板にアリクォートすることから始めます。フルステイン、蛍光マイナス1サンプル、蛍光各蛍光の不染色サンプルなど、すべてのサンプルとコントロールに十分なウェルが用意されていることを確認してください。骨髄成熟パネルおよび脾臓成熟パネルの場合、アリコート細胞は2つのウェルに、完全な染色サンプルごとにウェルあたり100万個の細胞である。
単色補正の生存率制御の場合は、各セルタイプのそれぞれについて 200 万個のセルを個々のウェルに追加します。845 x g でプレートを摂氏 4 度で 2 分間遠心します。上清を素早く反転させて、プレートをシンク上でフリックし、井戸を交差しないように注意します。
DPBSの200マイクロリットルで細胞を2回洗浄します。遠心分離機とデカント各洗浄後に上清。1~1000の比率でDPBSで希釈した生存性染料100マイクロリットルで細胞を再懸濁し、単色補正に使用する細胞を回避します。
各染色セットについて、完全に染色されていないサンプルや必要な他のコントロール、および生存率FMO制御のための追加の染色されていない井戸のために、いくつかの未染色の井戸を残します。これらの井戸にPBSを追加します。希釈された生存率染料の200マイクロリットルの単色補償生存率制御の細胞を再懸濁する。
これらの細胞の100マイクロリットルを1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移し、摂氏65度で5分間加熱し、加熱された細胞を残りの生きた細胞と共に元のウェルに戻します。光から保護された30分間、摂氏4度で細胞をインキュベートします。インキュベーション後、遠心分離し、他のウェルを交差汚染することなくプレートをフリックまたは反転させることによって上清をデカントします。
200マイクロリットルのDPBSで再懸濁して細胞を洗浄し、次に遠心分離機を使用し、以前のように上清をデカントします。DPBS を再度洗います。1~50の比率で染色バッファーで希釈したFCブロックのマイクロリットルを加えて、1ミリリットル当たり10マイクログラムの最終濃度を得る。
腹膜細胞の場合は、非特異的染色を減らすために5マイクロリットルの単球ブロッカーを加える。その後、光から保護された摂氏4度で細胞を15分間インキュベートする。テキスト原稿の抗体表を使用して、100万個の細胞あたり100マイクロリットルの最終体積に対して、完全な染色マスターミックスとFMOを染色バッファに用意します。
FCブロックを取り外さずに、100マイクロリットルのフルステインミックスとFPOを選択したウェルに追加します。各抗体とステインセットに対して単色補正コントロールを用意します。補償ビーズを使用する場合は、メーカーの指示に従ってください。
細胞とビーズを光から保護して摂氏4度で30分間インキュベートします。その後、遠心分離機をプレートを反転・フリックして上清をデカントします。200マイクロリットルの汚れバッファーで細胞とビーズを3回洗浄し、毎回遠心分離して上清をデカントします。
DPBSで2%パラホルムアルデヒドの200マイクロリットルの細胞とビーズを再懸濁し、分析のためにサンプルを固定します。セルとビーズを30分間摂氏4度でインキュベートし、光から保護し、遠心分離機を使用してプレートを反転またはフリックして上清をデカントします。200マイクロリットルの汚れバッファーで細胞とビーズを再懸濁します。
きれいな96ウェルU-底板の上にフィルタープレートを置き、各サンプルをマルチピペットを使用してフィルタープレートのウェルに移します。フィルタープレートを遠心分離し、上清をデカントします。骨髄および脾臓成熟パネルの場合、完全に染色された細胞を100マイクロリットルの汚れバッファーに再懸濁させる。
各動物のための2つの井戸を1つの井戸に組み合わせます。残りのパネル、FMO、およびコントロールを200マイクロリットルの汚れバッファーで再中断します。固定細胞とビーズを一晩摂氏4度でインキュベートし、光から保護します。
調製された単一の染色補償を使用して、各染色パネルの補償制御を記録し、各サンプルに正および負のゲートを設定します。ソフトウェアを使用して補償マトリックスを計算します。最初のサンプルを取得し、ゲートが適切に設定されていることを確認します。
テキスト原稿で述べたように、マシンを実行し、各サンプルの各種セルイベントを記録するように設定します。テキスト原稿の測定戦略に従って、フローサイトメトリー解析ソフトウェアを用いたデータ分析を進める。腹膜内の腹膜B細胞の特性解析に関するフローサイトメトリック解析は、実行可能な腹膜細胞、総B細胞、B-1およびB-2サブセット、ならびにマウスにおけるB-1aおよびB-1b細胞の頻度を示す。
骨髄B細胞を解析した場合、生存細胞の周波数、全B細胞、画率A、プレプロB細胞、画分B、画分C、画分C'Fraction D、未熟なフラクションE、移行画分E、およびマウスの画分FB細胞を決定した。脾臓B細胞の分析は、生細胞、総B細胞、過渡的B細胞、T1、T2、T3細胞、成熟B細胞、濾胞I細胞、濾胞II細胞、前駆体および成熟した限界ゾーン細胞、およびマウスにおけるB-1細胞の頻度を示す。マウスにおける免疫グロブリンカッパおよび免疫グロブリンλB細胞の頻度を、脾臓のフローサイトメトリック解析で決定した。
このプロトコルを実行する場合、補正コントロールを使用して、ある検出器から次のディテクタへの信号を次の検出器に解決する必要があります。これらのコントロールは、セルが1対一染色されるか、または市販の補償ビーズを有することができる。追加アッセイは、リンパ器官内の細胞局在化を可視化する免疫組織化学や、2つの光子顕微鏡検査など、フローサイトメトリーと組み合わせて使用して、リアルタイムおよび時間でB細胞応答を分析することができます。
B細胞区画のフローサイトメトリー解析は、BCRおよび関連する欠乏に関連する表形の特性評価、BCRシグナル伝達分子の摂動、またはB細胞生存を調節するサイトカインの破壊を可能にする。
