我々 はエラ Weinert、ミシェル ・ ヘルムズと優れたテクニカル サポート Marlis Badusche、イエカの分析にジェシカ Börstler、ノルベルト ・ ベッカー、Björn Pluskotaヒトスジシマカ卵とオリの Vapalahti を提供するために感謝します。ウイルスの株式市場を提供しています。ML に支えられたライプニッツ学術連合;番号見た-2014-SGN-3 を付与します。

1. メスの蚊を準備しなさい
<ol><li>大きなケージから蚊を収集するには、吸引器 (大きなケージあたり約 400 蚊) を使用します。</li>
	<li>7 の二酸化炭素 (CO2) 蚊を麻酔 s。</li>
	<li>プラスチック バイアルあたり 20 の女性を並べ替える (Ø 50 mm × 100 mm)。 注: 蚊が目覚める場合使用別 3 CO の s2.
</li>
	<li>一晩蚊を飢えさせます。</li>
</ol>2. 人工血液の食事
注: すべての手順は、BSL 3 条件の下で実行されます。
<ol><li>
感染症の血液の食事を準備します。
	<ol>
<li>ウイルス株式の 1 x 108プラーク形成単位 (PFU) の濃度を希釈/mL。 注: ストック濃度に組織培養感染量 50 法 (TCID50) を行うことで決定されスピアマン & Kärber アルゴリズムの10、11で計算。</li>
		<li>血液バンクから人間の血液 (血液保存) にミックスの有効期限が切れて (には適していない蚊の役に立つが、もう、人間) フルクトース (8% 溶液)、濾過されるウシ血清 (FBS)、ウイルス ストックの実用的なソリューション (人間の血: 果糖: FBS を期限切れ。実用的なソリューション 5:3:1:1 を =)。 注: 我々 は、ZIKV の知られている自然な哺乳類のホストは人間の血液を選んだ。</li>
	</ol>
</li>
	<li>吸血ミックス TCID50 によるさらなる分析のための 140 μ L を固定します。</li>
	<li>
種に応じて、さまざまな給餌方法を用いた人工栄養に従います。
	<ol>
<li>
ネッタイシマカ: 30 分 (フィーダーあたり 1 mL) システムを摂食膜を使用します。</li>
		<li>
イエカ属: 綿スティックを介して感染血液を一晩提供し、血 (バイアルあたり 300 μ L) を暖かくはありません。</li>
		<li>
ヒトスジシマカ: プラスチック バイアルに吸血ミックスの二液滴 (各 50 μ L) を入れて、2 時間フィード蚊を聞かせて。血液を暖かくはありません。 注: 最初の 15 分で蚊が給紙されます。長時間インキュベーション時間は、安全上の理由のため必要です。2 h、従って汚染リスクは減るの並べ替え中に蚊を供給後、血飛沫が減ります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>CO2 7 の蚊を麻酔 s。 注: 蚊が目覚める場合使用別 3 CO2の s。</li>
	<li>並べ替えとカウントは、新しいバイアルに蚊を完全に充血。</li>
	<li>果糖 (8% 溶液) バイアルとプラグインの間で飽和状態に、綿のパッドを追加します。</li>
	<li>14 または 21 日間の 18 ° C または 27 ° C 湿度 80% での指定の温度で蚊を維持します。</li>
	<li>果糖飽和綿パッドと蚊をフィードします。1.5 ml のバイアルあたり果糖 (8% 溶液) のすべての 72 h を補充 (20 蚊まで給餌によって速度、ステップ 2.5 を参照してください)。</li>
</ol>3. 強制 14 または 21 日に唾液分泌の試金
注: すべての手順は、BSL 3 条件の下で実行されます。
<ol><li>2 x 104 Vero 細胞をシード//、96 ウェル ウェル (Dulbecco´s 改変イーグル培地 (DMEM) 3 %fbs、100 U/mL ペニシリン、ストレプトマイシン 100 mg/mL、5 μ g/mL アムホテリシン B、2 mM L グルタミンを添加した培 200 μ L で、1% 非必須アミノ酸 (NEAA)、ピルビン酸ナトリウム 1%)。</li>
	<li>
唾液の分泌のデバイスを準備します。
	<ol>
<li>30 ° の角度でベンチに二乗ガラス板 (20 × 20 cm) を配置します。 注: これは安全ラボで伸ばしてくださいのために必要。プレートは水平方向または垂直方向に、液体のリークが発生します。</li>
		<li>ガラス板の上に両面テープを配置します。</li>
		<li>役割それまでモデリング粘土は 0.5 cm の直径に達する、両面粘着テープから 1 cm 水平に取り付けます。</li>
		<li>10 μ L フィルター チップの先端の最初の 0.3 cm を切った。 注: このバイオ研究所外実験を開始する前に準備する勧めします。</li>
		<li>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS、pH 7.4) の 10 μ L で、フィルターのヒントを入力します。</li>
		<li>粘着テープに向けてヒントとモデリング粘土にフィルターのヒントを配置します。</li>
		<li>穏やかな圧力とフィルターの先端を保護します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
蚊を準備します。
	<ol>
<li>CO2の蚊を麻酔します。</li>
		<li>脚と蚊を動けなく羽を削除します。</li>
		<li>フィルター チップ上粘着テープをリビング蚊の体を修正します。</li>
		<li>フィルター先端にそっと口吻を配置します。</li>
		<li>30 分の唾液分泌の試金を実行します。</li>
		<li>フィルターのヒントを削除し、粘土とテープを破棄します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 唾液の処理
注: 手順 4.1-4.6.2 は BSL 3 条件の下で実行されます。
<ol><li>10 μ L の PBS を含む反応管に内容を排出します。</li>
	<li>穏やかに混合し、サンプルあたり 1 つの井戸を使用して準備された 96 well プレートのウェルにコンテンツを転送します。</li>
	<li>5% CO2と 37 ° C で 7 日間の版を孵化させなさい。</li>
	<li>両眼を使用して、セル細胞変性効果 (CPE) の存在を確認します。</li>
	<li>井戸が CPE の正の場合は、RNA の抽出のための反応管にピペッティング 140 μ L で上澄みを収穫します。</li>
	<li>
RNA 抽出キットを使用して RNA を浄化します。
	<ol>
<li>AVL の 560 μ L で上澄みのミックス 140 μ L (ウイルスの換散バッファー) をバッファーし、室温で 10 分間インキュベートします。</li>
		<li>エタノール (96%) の渦サンプル 560 μ L を追加します。 注: サンプルはこの手順後不活化し、BSL 3 研究室から排出することができます。</li>
		<li>ピペット 630 μ L 列と 1 分 6,000 × g で遠心分離機にサンプルの。</li>
		<li>ろ液は、列の残りの 630 μ L ピペットを破棄し、遠心分離を繰り返します。</li>
		<li>RNA を洗って、1 分間 6,000 x gでバッファー 1 列と遠心分離機を洗浄 500 μ L を追加することによって、列の生体膜に結合します。</li>
		<li>コレクションの管を破棄し、新しいコレクションの管に列を配置します。3 分 12,500 x gで 500 μ L 洗浄バッファー 2 と遠心分離機を追加します。</li>
		<li>コレクションの管を破棄し、反作用の管を 1.5 mL に列を配置します。</li>
		<li>溶出バッファーの 50 μ L を追加し、室温で 1 分間インキュベートします。</li>
		<li>1 分間 6,000 × gで遠心分離し、列を破棄します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>RT qPCR を介して ZIKV RNA のサンプルを分析します。</li>
</ol>5. 蚊体処理
注: 手順 5.1-5.5 は、BSL 3 条件の下で実行されます。
<ol><li>蚊の体を取り外し、反応管に各個体を置きます。 注: この時点で実験を一時停止し、-80 ° C で試料を保存することが可能です。</li>
	<li>反応管に均質化メディア (DMEM 任意 supplementals なし) 500 μ L を追加します。</li>
	<li>ハンド モーター ミキサーを使用して体を均質化し、各サンプルに関して新しい雌しべを使用します。</li>
	<li>浄化の 96 ウェル プレートに磨砕液 200 μ L を追加します。 注: この時点で実験を一時停止し、-80 ° C で試料を保存することが可能です。</li>
	<li>60 ° C で 60 分間インキュベーションでプレートを不活性化します。</li>
	<li>自動核酸精製によって RNA を浄化します。 注: この時点で実験を一時停止し、-80 ° C で試料を保存することが可能です。</li>
</ol>6. 分析
<ol><li>RT qPCR を使用してウイルスの RNA のコピーを定量化します。 注: すべての ZIKV 肯定的な蚊の体と ZIKV 負蚊を含めずに RNA のコピーを平均しました。</li>
	<li>ZIKV 陽性蚊体供給, 個体数あたりの数として定義、IR を計算します。</li>
	<li>ZIKV 陽性 ZIKV 陽性蚊体の数で唾液で蚊の数として定義されている TR を計算します。伝送速度は可能性がありますは ZIKV 陽性の遺体と一緒に種温度の組み合わせ計算されません。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Musso, D., Gubler, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus.">Zika Virus.</a> Clinical Microbiology Reviews. (3), 487-524 (2016).</li><li>Epelboin, Y., Talaga, S., Epelboin, L., Dusfour, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus:+An+updated+review+of+competent+or+naturally+infected+mosquitoes.">Zika virus: An updated review of competent or naturally infected mosquitoes.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 11 (11), e0005933 (2017).</li><li>Aliota, M. T., Peinado, S. A., Osorio, J. E., Bartholomay, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culex+pipiens+and+Aedes+triseriatus+Mosquito+Susceptibility+to+Zika+Virus.">Culex pipiens and Aedes triseriatus Mosquito Susceptibility to Zika Virus.</a> Emerging Infectious Diseases. (10), 1857-1859 (2016).</li><li>Turell, M. J., Linthicum, K. J., Patrican, L. A., Davies, F. G., Kairo, A., Bailey, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+competence+of+selected+African+mosquito+(Diptera:+Culicidae)+species+for+Rift+Valley+fever+virus.">Vector competence of selected African mosquito (Diptera: Culicidae) species for Rift Valley fever virus.</a> Journal of Medical Entomology. 45 (1), 102-108 (2008).</li><li>Cornel, A. J., Jupp, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+methods+for+determining+transmission+rates+in+vector+competence+studies+with+Culex+univittatus+and+West+Nile+and+Sindbis+viruses.">Comparison of three methods for determining transmission rates in vector competence studies with Culex univittatus and West Nile and Sindbis viruses.</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 5 (1), 70-72 (1989).</li><li>Hurlbut, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+salivation+and+virus+transmission.">Mosquito salivation and virus transmission.</a> The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 15 (6), 989-993 (1966).</li><li>Anderson, S. L., Richards, S. L., Smartt, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+determining+arbovirus+transmission+in+mosquitoes.">A simple method for determining arbovirus transmission in mosquitoes.</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 26 (1), 108-111 (2010).</li><li>Heitmann, A., Jansen, S., L&#252;hken, R., Leggewie, M., Badusche, M., Pluskota, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+transmission+of+Zika+virus+by+mosquitoes+from+central+Europe.">Experimental transmission of Zika virus by mosquitoes from central Europe.</a> Eurovsurveillance. 22 (2), (2017).</li><li>Hierholzer, J. C., Killington, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Virus Isolation and Quantitation - Virology methods manual. , (1996).</li><li>Horzinek, R. W., Marian, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kompendium+der+allgemeinen+Virologie.">Kompendium der allgemeinen Virologie.</a> Zentralblatt f&#252;r Veterin&#228;rmedizin R A. 32 (1-10), 480 (2010).</li><li>Richard, V., Paoaafaite, T., Cao-Lormeau, V. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence+of+French+Polynesian+Aedes+aegypti+and+Aedes+polynesiensis+for+Zika+Virus.">Vector Competence of French Polynesian Aedes aegypti and Aedes polynesiensis for Zika Virus.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (9), (2016).</li><li>Fortuna, C., Remoli, M. E., Di Luca, M., Severini, F., Toma, L., Benedetti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+studies+on+comparison+of+the+vector+competence+of+four+Italian+Culex+pipiens+populations+for+West+Nile+virus.">Experimental studies on comparison of the vector competence of four Italian Culex pipiens populations for West Nile virus.</a> Parasites &amp; Vectors. 8, 463 (2015).</li><li>Weger-Lucarelli, J., R&#252;ckert, C., Chotiwan, N., Nguyen, C., Garcia Luna, S. M., Turell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence+of+American+Mosquitoes+for+Three+Strains+of+Zika+Virus.">Vector Competence of American Mosquitoes for Three Strains of Zika Virus.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), (2016).</li><li>Dubrulle, M., Mousson, L., Moutailler, S., Vazeille, M., Failloux, A. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus+and+Aedes+mosquitoes:+saliva+is+infectious+as+soon+as+two+days+after+oral+infection.">Chikungunya virus and Aedes mosquitoes: saliva is infectious as soon as two days after oral infection.</a> PLOS ONE. 4 (6), e5895 (2009).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

以前、古典の再給餌実験6に沿って強制唾液の分泌により得られた結果が示されています。ただし、両方で再実験を給餌、強制唾液分泌の提示手法じゃない直接唾液分泌活動を証明または唾液の放出を監視することが可能。唾液の分泌活動を証明する唾液に存在するその他のコンポーネント サンプルをテストでした (e.g。、蛋白質、炭水化物など。)。さらに、追加の qPCRs は、ウイルスの RNA のコピーの検出になります。これは、ただし、唾液のサンプル様々 な解析では、非常に低い粒子数の場合細胞培養の試金の感受性が制限される場合の分割が必要です。ターンでは、これは断固とした伝送レートの過小評価につながる可能性があります。
再現性のある結果を得るのため、実験終了時まで、すべての蚊が生き続けることを確認する必要です。これは蚊の身体運動活動を視覚的に監視することによって制御されます。さらに、与えられた蚊種の唾液分泌の試金の原則使用はコントロール ウイルスは、この特定の蚊種によって感染すると知られている供給によってテストされます。逆に、実験に導入されたすべてのウイルス感受性蚊でテストするがあります。
強制唾液分泌の試金には、多くの利点があります。蚊の高い数字は、基本制御の標準化された条件の下で単一の標本で動物福祉規則9と競合することがなく、同時にテストできます。
メソッドは、いくつかの研究所によって使用されます。ただし、研究室間の結果の違いにつながることができる正確なセットアップは異なる場合があります。1 つの重要なコンポーネントは、ガラス14またはプラスチック15の作ることができる唾液を収集するために毛細血管です。バイオ セーフティ レベル 3 横の高い安全基準を遵守するためフィルター チップの代わりに使ってガラス管、怪我のリスクを減らします。さらに、フィルターのヒントには、ピペットを使用して集められた液体を転送する簡単にことができます利点があります。
ここに示す強制唾液分泌の試金のセットアップは、連携して職務を共有研究者 2 名に基づいています。他は同時に強制唾液分泌のセットアップを準備している間、蚊の demobilizing は一人で行います。これは、大幅に処理時間を短縮し、リスクを最小限に抑えるサンプルのスイッチとして復員職場と流涎プレートの間を変更する必要はありません。さらに、復員直後後強制唾液デバイス蚊に置くことができます。この幾分短い蚊の処理時間は成功した強制唾液分泌に不可欠です。最後に、全体の実験中の蚊を直接監視できます。
ここで紹介唾液分泌の試金は、蚊のベクトル ポテンシャルに洞察力を得るために使用されます。ただし、いくつかの他の特定の質問に答える (e.g。、蚊に刺され脊椎動物に感染するために必要な数)、動物実験が必要な可能性があります。

フラビコロンビア、ブラジルに登場し、急速に広がったアメリカ大陸とカリブ海の間での注目すべき数字と流行を引き起こしてファミリーに属する蚊媒介ウイルス (mobovirus) の関連付けられたジカ (ZIKV)、2015 年に小頭症とギラン症候群の1症例ネッタイシマカとヒトスジシマカの種の蚊が ZIKV2のプライマリとセカンダリのベクトルと見なされますが、ヤブカ属の他の種がまた実験的ベクトル能力3 を持っている証明.ヤブカ属の種と対照をなしてこれまでテストアカイエカ種のほとんどはウイルス4を送信することがありません。単に、ネッタイイエカのデータは決定的な結果3を提供しました。現時点では、情報が欠けている蚊ベクトル能力 ZIKV の適当な温度条件の下で (< 20 ° C)。ただし、この情報は中央ヨーロッパなどの温帯気候地域に可能なスプレッドのリスク評価に実質的です。
ZIKV の有能なベクトル、取得、維持、増幅し、最後にウイルスを送信することができます。したがって、テスト蚊ボディまたはボディの部分、ZIKV の足、腸、頭や唾液腺を含むはありませんベクトル能力を決定するのに十分です。リリースされた唾液内の感染性ウイルス粒子をテストするは必須です。ベクトル能力を評価するために感染率 (IR, 吸血蚊の数 ZIKV 陽性蚊体数) と伝送速度 (トランジスタ、ZIKV 陽性 ZIKV 陽性蚊体の数で唾液で蚊の数)、する必要があります。決定されます。逆転写酵素実時間ポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR-RT) 続いて単に均質化蚊によって蚊の IRs を簡単に分析できる ZIKV を対象とします。さらに、感染症は、蚊あたりウイルス コピー数を決定することによってさらに特徴付けられます。対照的に、透過率の分析は、個々 の蚊の唾液中実行可能なウイルス粒子の検出に依存します。これは、ホスト5におけるウイルス血症の分析に続いて、感受性宿主動物に感染した蚊の餌によって達成することができます。ただし、このメソッドは適切なモデル生物に依存し、コストがかかり、動物福祉規則によって制限されています。伝送レートの分析に実験動物の使用を回避し、コストを削減するには、再供給システム人工血しぶきがされているを使用して記述されている6。しかし、高個体数と組み合わせて個々 のスケールのテストは難しいと時間がかかるです。個々 の規模の唾液分泌の試金の最初の説明が掲載されました 1966年7と強制の唾液分泌の実験、近年中に蚊3,8 のベクトル能力を評価するための最適な方法となっています。.
基づく中央ヨーロッパのベクトル能力研究蚊公開最近9、アンダーソンらによって報告された強制唾液分泌について述べる。8いくつかの変更。このメソッドにより、標準化高スループット高いバイオ セーフティ レベル条件 (BSL-3) 実験、細胞による培養の試金によってアクティブなウイルスの識別が含まれています。ここで説明した実験には、856 蚊が含まれます。ZIKV 人工吸血による感染、その後唾液で感染性のウイルス粒子の存在を分析します。実験で構成される 2 つの老舗実験Ae。 ネッタイシマカとチカイエカ アカイエカのバイオタイプチカイエカ(チカイエカ) としてフィールドの個体群に導入された蚊キャッチアカイエカアカイエカ アカイエカバイオタイプ アカイエカ (cx p. アカイエカ)、アカイエカ torrentium (cx torrentium)、2 つのAe。 ヒトスジシマカ集団。イタリアで収集された、2 つのAe。 ヒトスジシマカ集団の 1 つを除いてすべての蚊はドイツで収集されました。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Inject+matic Sleeper</td>
			<td>Inject+matic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bugdorm-1 Insect Rearing Cage</td>
			<td>BugDorm Store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila cultivation tubes</td>
			<td>carl roth</td>
			<td>PK11.2</td>
			<td>plastic vial for mosquitoes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plug for drosophila cultivation tubes</td>
			<td>carl roth</td>
			<td>PK15.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant climate chamber</td>
			<td>Binder</td>
			<td>KBF-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>banked human blood, expired, not usable for medical application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont-Pincette Electronic SS</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>B40c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>BNITM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flash light aspirator</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>2809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double-sided adhesive tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>no specific provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gammex Powder-free gloves with AMT</td>
			<td>Ansell</td>
			<td></td>
			<td>for safety reasons necessary during work with pricks in the BSL3 laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RealStar Zika Virus RT-PCR-Kit</td>
			<td>altona diagnostics</td>
			<td>591013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagMax Pathogen RNA/DNA Kit</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>4462359</td>
			<td>RNA isolation of mosquito bodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiamp viral RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>52906</td>
			<td>RNA-Isolation of supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter tips (20 &#181;L)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>701,116,210</td>
			<td>Cut the first 3 mm of the tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hand motor mixer</td>
			<td>carl roth</td>
			<td>sold out</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro pestles for hand motor mixer</td>
			<td>carl roth</td>
			<td>CXH8.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td></td>
			<td>P0403550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L Glutamine Penicilin/Streptomycin</td>
			<td>PAN</td>
			<td>P0819100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>PAN</td>
			<td>P06-0110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fructose</td>
			<td>carl roth</td>
			<td>4981.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>PAN</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>PAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvat</td>
			<td>PAN</td>
			<td>P0443100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NAA</td>
			<td>PAN</td>
			<td>P0832100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemotek Feeder</td>
			<td>Hemotek</td>
			<td>PS6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Cycler</td>
			<td>Roche</td>
			<td>480 II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Cycler Software</td>
			<td>Roche</td>
			<td>480 SW 1.5.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeling clay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>no specific provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>King Fisher Flex Purification System</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aedes albopictus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>eggs were collected in Freiburg, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular</td>
			<td>MOTIC</td>
			<td>SMZ-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular light</td>
			<td>MOTIC</td>
			<td>MLC-150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2-Incubator</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>MIDI 40</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

forced salivation as a method to analyze vector competence of mosquitoes

ベクトル能力は蚊種の脊椎動物のホストに蚊媒介ウイルス (mobovirus) を送信可能性として定義されます。実行可能なウイルス粒子は感染蚊の唾液を介して血液の食事中に送信されます。強制唾液分泌の試金は、動物実験の使用を避け、単一の蚊に基づくベクトル ポテンシャルの決定を許可します。メソッドは、時間の短い期間内に 1 つの実験で蚊の数が多いを分析に適しています。ドイツ、2 つの異なるを含むに閉じ込められた 856 個体を用い強制唾液分泌の試金チカイエカ アカイエカバイオタイプアカイエカ torrentiumとして感染したヒトスジシマカ、 ジカ ウイルス (ZIKV) および 18 ° C または 2 〜 3 週間の 27 ° C で培養。結果は、ZIKV の別のアカイエカ群のベクトル能力の欠如を示した。対照的に、ヒトスジシマカは 27 ° C、ネッタイシマカ研究所植民地を並行してテストに類似した伝送レートでしか ZIKV に感受性であった。

ネッタイシマカとして知られている有能なベクトル ZIKV の少なくとも12熱帯の気候条件の下で。したがって、我々 は肯定的な制御としてAe。 ネッタイシマカを使用アッセイを確立し、IRs として 27 ° C の孵化の温度、湿度 80% で TRs を分析します。IR と TR は、フォルトゥーナらによって前述したように定義されました。13。 挑戦Ae。 ネッタイシマカ50%、72% の IR と TR 42% と 31% 14, 21 日目にそれぞれ感染 (dpi) のポストを示した (図 1 aと1 b)。その後、欧州蚊 ZIKV 感染症、熱帯と温帯の気候条件を用いた伝送テストされています。
27 ° C の孵化の温度、すべて蚊種 14 dpi として 14 dpi のみで陽性であったcx p. アカイエカとcx torrentium個人以外の 21 dpi ZIKV 感染症を示した。ヤブカ属のすべての種がウイルス RNA 濃度が高いだけでなく、高い IRs (間 50%、72%) を示した (106 109 RNA コピー/蚊標本まで) 0 まで IRs、明らかに異なるアカイエカ群と比較して% 32% と 10 のウイルス負荷3 104 RNA コピー/蚊標本にします。アカイエカ群から唾液のサンプルのどれも ZIKV (図 1 aおよび1 b) に含まれるに対し、ヤブカ属のすべての種は ZIKV 陽性唾 (TR 13-42%) を表示されます。興味深いことに、21 dpi で伝送速度 (30%)、ドイツからAe。 ネッタイシマカとヒトスジシマカ Ae。類似していたが, 実質的にイタリアからヒトスジシマカ Ae。 (13%)。
低いウイルス負荷ヤブカ属種 (104– 106 RNA コピー/蚊) だけでなく別のアカイエカ群 (102-104、18 ° C の適当な温度で挑戦された蚊の孵化が一般に明らかにしました。RNA のコピー/蚊)。ただし、18 ° C の孵化の温度で ZIKV の伝送は観察されなかった, 蚊種のいずれかの.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57980/57980fig1.jpg"> 図 1: ZIKV 感染蚊の伝達率。別の蚊の種で ZIKV とベクトル能力研究の結果。分類群別の蚊 6 ZIKV に感染している、(B) の 21 日間または 14 (A) 18 ° C 27 ° C で培養しました。TR は、ZIKV 陽性 ZIKV 陽性蚊体の数で唾液で蚊の数として定義されます。蚊の調査の合計数は各時間のポイント/温度/蚊分類群の 30 人を最小限に抑えて、856 だった<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57980/57980fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

蚊のベクトル能力を分析する方法として唾液の分泌を強制

蚊媒介性ウイルス伝達の効率的な管理は、それぞれ蚊のベクトル ポテンシャルの知識が注目です。ヒトスジシマカと 3 異なるアカイエカ種はジカの伝達のためのベクトル能力を分析する方法として強制唾液分泌について述べる。

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...

forced-salivation-as-method-to-analyze-vector-competence

Research

JoVE Journal

Biology

9.5K ビュー.  Bernhard Nocht Institute for Tropical Medicine. 蚊媒介性ウイルス伝達の効率的な管理は、それぞれ蚊のベクトル ポテンシャルの知識が注目です。ヒトスジシマカと 3 異なるアカイエカ種はジカの伝達のためのベクトル能力を分析する方法として強制唾液分泌について述べる。

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Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This video protocol demonstrates a method used by the James laboratory to microinject DNA constructs into Anopheles stephensi embryos for the generation of transformed mosquitoes. Techniques for preparing microinjection needles, collecting and preparing embryos and performing the microinjection are illustrated.

Anopheles stephensi mosquitoes are vectors for malaria inhabiting India and throughout Asia. This video demonstrates the technique for performing microinjections of this species with transgenes that will confer resistance to the malaria to the mosquito. Much of the methodology demonstrated in this video is applicable to microinjection techniques of other mosquito species.

の注入。ハマダラカの胚は、マラリア耐性の蚊を生成する

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This ...

生物学

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

トランスジェニック蚊を取得するA.ネッタイシマカの胚のマイクロインジェクション

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a rotorod, animals remain in approximately the same place making repetitive movements of stepping. Thus the task provides a rich source of information on the details of foot stepping movements. Subjects were hemi-Parkinson analogue rats, produced by injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) into the right nigrostriatal bundle to deplete nigrostriatal dopamine (DA). The present report provides a video analysis illustration of animals previously were filmed from frontal, lateral, and posterior views as they walked (15). Rating scales and frame-by-frame replay of the video records of stepping behavior indicated that the hemi-Parkinson rats were chronically impaired in posture and limb use contralateral to the DA-depletion. The contralateral limbs participated less in initiating and sustaining propulsion than the ipsilateral limbs. These deficits secondary to unilateral DA-depletion show that the rotorod provides a use task for the analysis of stepping movements.

The rotorod test is used to assess motor status in the walking movement of hemi-Parkinson analogue rats.

ラットの歩行の質的分析のための方法としてRotorodの使用

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

遺伝子機能を解析するためにゼブラフィッシュ胚のマイクロインジェクション

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

磁気活性化細胞選別（LIMACS）を使用して、脂質小胞を介したアフィニティクロマトグラフィー：タンパク質脂質相互作用を解析する新手法

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, several traits are typically characterized using molecular assays to aid in epidemiological studies. These traits include species identification, insecticide resistance, parasite infection status, and host preference. Since populations of the Anopheles gambiae complex are morphologically indistinguishable, a polymerase chain reaction (PCR) is traditionally used to identify species. Once the species is known, several downstream assays are routinely performed to elucidate further characteristics. For instance, mutations known as KDR in a para gene confer resistance against DDT and pyrethroid insecticides. Additionally, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) or Plasmodium parasite DNA detection PCR assays are used to detect parasites present in mosquito tissues. Lastly, a combination of PCR and restriction enzyme digests can be used to elucidate host preference (e.g., human vs. animal blood) by screening the mosquito bloodmeal for host-specific DNA. We have developed a multi-detection assay (MDA) that combines all of the aforementioned assays into a single multiplex reaction genotyping 33SNPs for 96 or 384 samples at a time. Because the MDA includes multiple markers for species, Plasmodium detection, and host blood identification, the likelihood of generating false positives or negatives is greatly reduced from previous assays that include only one marker per trait. This robust and simple assay can detect these key mosquito traits cost-effectively and in a fraction of the time of existing assays.

Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.

マラリア蚊。送信のためのマルチ検出分析

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, chikungunya and Zika. Wolbachia-infected mosquitoes can be released into the field to either reduce population sizes through incompatible matings or to transform populations with mosquitoes that are refractory to virus transmission. For these strategies to succeed, the mosquitoes released into the field from the laboratory must be competitive with native mosquitoes. However, maintaining mosquitoes in the laboratory can result in inbreeding, genetic drift and laboratory adaptation which can reduce their fitness in the field and may confound the results of experiments. To test the suitability of different Wolbachia infections for deployment in the field, it is necessary to maintain mosquitoes in a controlled laboratory environment across multiple generations. We describe a simple protocol for maintaining Ae. aegypti mosquitoes in the laboratory, which is suitable for both Wolbachia-infected and wild-type mosquitoes. The methods minimize laboratory adaptation and implement outcrossing to increase the relevance of experiments to field mosquitoes. Additionally, colonies are maintained under optimal conditions to maximize their fitness for open field releases.

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes infected with Wolbachia are being released into natural populations to suppress the transmission of arboviruses. We describe methods to rear Ae. aegypti with Wolbachia infections in the laboratory for experiments and field release, taking precautions to minimize laboratory adaptation and selection.

ネッタイシマカ蚊ボルバキアに感染維持

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such as Zika, dengue and malaria. Assays for rapid, high-throughput analyses of unformulated novel chemistries against mosquito larvae and adults are presented. We describe protocols for single point-dose and dose response assays to evaluate the toxicity of small molecule chemistries to the Aedes aegypti vector of Zika, dengue and yellow fever,&#160;the malaria vector, Anopheles gambiae and the northern house mosquito, Culex quinquefasciatus, on contact and via ingestion. As an example, we evaluated the toxicity of amitriptyline, a small molecule antagonist of G protein-coupled receptors, via larval, adult topical and adult blood-feeding assay. The protocols provide a starting point to investigate insecticide potential. Results are discussed in the context of additional experiments to explore product applications and mechanisms for delivery.

Protocols are described for assessing the toxicity of chemistries to immature and adult mosquitoes for development as new classes of larvicides, adulticides and endectocides. The protocols enable high-throughput testing of multiple chemistries at single-point dose and subsequent evaluation via dose response assay to determine toxicity on contact or via ingestion.

蚊を殺虫化合物小説の毒性試験のプロトコル

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...

A Blood-Free Diet to Rear Anopheline Mosquitoes

Malaria research requires large-scale breeding and production conditions for mosquitoes (Anopheles spp.) in captivity. The sustainable and reliable production of mosquitoes is currently inhibited by the supply of fresh vertebrate blood. Alternatives to blood are required to promote efficient control strategies for malaria and other vector borne diseases that are transmitted by blood feeding insects. With this in mind, artificial liquid diets were formulated as substitutes for fresh vertebrate blood. Herein we report a blood-free artificial liquid diet that delivers feeding rates similar to blood and mimics the physiological effects of a fresh vertebrate blood meal. The diet induces ovarian and egg maturation of Anopheles mosquitoes and also produces good larval survival and development of functional adults. The formulated blood-free liquid diet is an important advance towards sustainable mosquito breeding in captivity and will reduce the maintenance costs of mosquito colonies and eliminate the need for fresh vertebrate blood.

A protocol is presented for formulation of a blood-free artificial diet to feed Anopheles mosquitoes in captivity. This diet has a similar performance to vertebrate blood and triggers oogenesis and egg maturation and produces viable adult progeny.

アノフェリン蚊を後ろにする無血ダイエット

Malaria research requires large-scale breeding and production conditions for mosquitoes (Anopheles spp.) in captivity. The sustainable and reliable ...

Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of pathways involved in parietal epithelial cell activation could therefore be a tool to attenuate the progression of glomerular diseases. This article describes a method to culture and analyze parietal epithelial cell outgrowth of encapsulated glomeruli isolated from mouse kidney. After dissecting isolated mouse kidneys, the tissue is minced, and glomeruli are isolated by sieving. Encapsulated glomeruli are collected, and single glomeruli are cultured for 6 days to obtain glomerular outgrowth of parietal epithelial cells. During this period, parietal epithelial cell proliferation and migration can be analyzed by determining the cell number or the surface area of outgrowing cells. This assay can therefore be used as a tool to study the effects of an altered gene expression in transgenic- or knockout-mice or the effects of culture conditions on parietal epithelial cell growth characteristics and signaling. Using this method, important pathways involved in the process of parietal epithelial cell activation and consequently in glomerulosclerosis can be studied.

This article describes a method for culturing and analyzing glomerular parietal epithelial cell outgrowths of encapsulated glomeruli isolated from mouse kidney. This method can be used to study pathways involved in parietal epithelial cell proliferation and migration.

上頭頂皮細胞活性化に関与する経路を解析するエクスビボアッセイとしての糸球体成長

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of ...