Name: forced salivation as a method to analyze vector competence of mosquitoes
Uploaded: 2018-08-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
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我々 はエラ Weinert、ミシェル ・ ヘルムズと優れたテクニカル サポート Marlis Badusche、イエカの分析にジェシカ Börstler、ノルベルト ・ ベッカー、Björn Pluskotaヒトスジシマカ卵とオリの Vapalahti を提供するために感謝します。ウイルスの株式市場を提供しています。ML に支えられたライプニッツ学術連合;番号見た-2014-SGN-3 を付与します。

1. メスの蚊を準備しなさい
<ol><li>大きなケージから蚊を収集するには、吸引器 (大きなケージあたり約 400 蚊) を使用します。</li>
	<li>7 の二酸化炭素 (CO2) 蚊を麻酔 s。</li>
	<li>プラスチック バイアルあたり 20 の女性を並べ替える (Ø 50 mm × 100 mm)。 注: 蚊が目覚める場合使用別 3 CO の s2.
</li>
	<li>一晩蚊を飢えさせます。</li>
</ol>2. 人工血液の食事
注: すべての手順は、BSL 3 条件の下で実行されます。
<ol><li>
感染症の血液の食事を準備します。
	<ol>
<li>ウイルス株式の 1 x 108プラーク形成単位 (PFU) の濃度を希釈/mL。 注: ストック濃度に組織培養感染量 50 法 (TCID50) を行うことで決定されスピアマン & Kärber アルゴリズムの10、11で計算。</li>
		<li>血液バンクから人間の血液 (血液保存) にミックスの有効期限が切れて (には適していない蚊の役に立つが、もう、人間) フルクトース (8% 溶液)、濾過されるウシ血清 (FBS)、ウイルス ストックの実用的なソリューション (人間の血: 果糖: FBS を期限切れ。実用的なソリューション 5:3:1:1 を =)。 注: 我々 は、ZIKV の知られている自然な哺乳類のホストは人間の血液を選んだ。</li>
	</ol>
</li>
	<li>吸血ミックス TCID50 によるさらなる分析のための 140 μ L を固定します。</li>
	<li>
種に応じて、さまざまな給餌方法を用いた人工栄養に従います。
	<ol>
<li>
ネッタイシマカ: 30 分 (フィーダーあたり 1 mL) システムを摂食膜を使用します。</li>
		<li>
イエカ属: 綿スティックを介して感染血液を一晩提供し、血 (バイアルあたり 300 μ L) を暖かくはありません。</li>
		<li>
ヒトスジシマカ: プラスチック バイアルに吸血ミックスの二液滴 (各 50 μ L) を入れて、2 時間フィード蚊を聞かせて。血液を暖かくはありません。 注: 最初の 15 分で蚊が給紙されます。長時間インキュベーション時間は、安全上の理由のため必要です。2 h、従って汚染リスクは減るの並べ替え中に蚊を供給後、血飛沫が減ります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>CO2 7 の蚊を麻酔 s。 注: 蚊が目覚める場合使用別 3 CO2の s。</li>
	<li>並べ替えとカウントは、新しいバイアルに蚊を完全に充血。</li>
	<li>果糖 (8% 溶液) バイアルとプラグインの間で飽和状態に、綿のパッドを追加します。</li>
	<li>14 または 21 日間の 18 ° C または 27 ° C 湿度 80% での指定の温度で蚊を維持します。</li>
	<li>果糖飽和綿パッドと蚊をフィードします。1.5 ml のバイアルあたり果糖 (8% 溶液) のすべての 72 h を補充 (20 蚊まで給餌によって速度、ステップ 2.5 を参照してください)。</li>
</ol>3. 強制 14 または 21 日に唾液分泌の試金
注: すべての手順は、BSL 3 条件の下で実行されます。
<ol><li>2 x 104 Vero 細胞をシード//、96 ウェル ウェル (Dulbecco´s 改変イーグル培地 (DMEM) 3 %fbs、100 U/mL ペニシリン、ストレプトマイシン 100 mg/mL、5 μ g/mL アムホテリシン B、2 mM L グルタミンを添加した培 200 μ L で、1% 非必須アミノ酸 (NEAA)、ピルビン酸ナトリウム 1%)。</li>
	<li>
唾液の分泌のデバイスを準備します。
	<ol>
<li>30 ° の角度でベンチに二乗ガラス板 (20 × 20 cm) を配置します。 注: これは安全ラボで伸ばしてくださいのために必要。プレートは水平方向または垂直方向に、液体のリークが発生します。</li>
		<li>ガラス板の上に両面テープを配置します。</li>
		<li>役割それまでモデリング粘土は 0.5 cm の直径に達する、両面粘着テープから 1 cm 水平に取り付けます。</li>
		<li>10 μ L フィルター チップの先端の最初の 0.3 cm を切った。 注: このバイオ研究所外実験を開始する前に準備する勧めします。</li>
		<li>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS、pH 7.4) の 10 μ L で、フィルターのヒントを入力します。</li>
		<li>粘着テープに向けてヒントとモデリング粘土にフィルターのヒントを配置します。</li>
		<li>穏やかな圧力とフィルターの先端を保護します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
蚊を準備します。
	<ol>
<li>CO2の蚊を麻酔します。</li>
		<li>脚と蚊を動けなく羽を削除します。</li>
		<li>フィルター チップ上粘着テープをリビング蚊の体を修正します。</li>
		<li>フィルター先端にそっと口吻を配置します。</li>
		<li>30 分の唾液分泌の試金を実行します。</li>
		<li>フィルターのヒントを削除し、粘土とテープを破棄します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 唾液の処理
注: 手順 4.1-4.6.2 は BSL 3 条件の下で実行されます。
<ol><li>10 μ L の PBS を含む反応管に内容を排出します。</li>
	<li>穏やかに混合し、サンプルあたり 1 つの井戸を使用して準備された 96 well プレートのウェルにコンテンツを転送します。</li>
	<li>5% CO2と 37 ° C で 7 日間の版を孵化させなさい。</li>
	<li>両眼を使用して、セル細胞変性効果 (CPE) の存在を確認します。</li>
	<li>井戸が CPE の正の場合は、RNA の抽出のための反応管にピペッティング 140 μ L で上澄みを収穫します。</li>
	<li>
RNA 抽出キットを使用して RNA を浄化します。
	<ol>
<li>AVL の 560 μ L で上澄みのミックス 140 μ L (ウイルスの換散バッファー) をバッファーし、室温で 10 分間インキュベートします。</li>
		<li>エタノール (96%) の渦サンプル 560 μ L を追加します。 注: サンプルはこの手順後不活化し、BSL 3 研究室から排出することができます。</li>
		<li>ピペット 630 μ L 列と 1 分 6,000 × g で遠心分離機にサンプルの。</li>
		<li>ろ液は、列の残りの 630 μ L ピペットを破棄し、遠心分離を繰り返します。</li>
		<li>RNA を洗って、1 分間 6,000 x gでバッファー 1 列と遠心分離機を洗浄 500 μ L を追加することによって、列の生体膜に結合します。</li>
		<li>コレクションの管を破棄し、新しいコレクションの管に列を配置します。3 分 12,500 x gで 500 μ L 洗浄バッファー 2 と遠心分離機を追加します。</li>
		<li>コレクションの管を破棄し、反作用の管を 1.5 mL に列を配置します。</li>
		<li>溶出バッファーの 50 μ L を追加し、室温で 1 分間インキュベートします。</li>
		<li>1 分間 6,000 × gで遠心分離し、列を破棄します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>RT qPCR を介して ZIKV RNA のサンプルを分析します。</li>
</ol>5. 蚊体処理
注: 手順 5.1-5.5 は、BSL 3 条件の下で実行されます。
<ol><li>蚊の体を取り外し、反応管に各個体を置きます。 注: この時点で実験を一時停止し、-80 ° C で試料を保存することが可能です。</li>
	<li>反応管に均質化メディア (DMEM 任意 supplementals なし) 500 μ L を追加します。</li>
	<li>ハンド モーター ミキサーを使用して体を均質化し、各サンプルに関して新しい雌しべを使用します。</li>
	<li>浄化の 96 ウェル プレートに磨砕液 200 μ L を追加します。 注: この時点で実験を一時停止し、-80 ° C で試料を保存することが可能です。</li>
	<li>60 ° C で 60 分間インキュベーションでプレートを不活性化します。</li>
	<li>自動核酸精製によって RNA を浄化します。 注: この時点で実験を一時停止し、-80 ° C で試料を保存することが可能です。</li>
</ol>6. 分析
<ol><li>RT qPCR を使用してウイルスの RNA のコピーを定量化します。 注: すべての ZIKV 肯定的な蚊の体と ZIKV 負蚊を含めずに RNA のコピーを平均しました。</li>
	<li>ZIKV 陽性蚊体供給, 個体数あたりの数として定義、IR を計算します。</li>
	<li>ZIKV 陽性 ZIKV 陽性蚊体の数で唾液で蚊の数として定義されている TR を計算します。伝送速度は可能性がありますは ZIKV 陽性の遺体と一緒に種温度の組み合わせ計算されません。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Musso, D., Gubler, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus.">Zika Virus.</a> Clinical Microbiology Reviews. (3), 487-524 (2016).</li><li>Epelboin, Y., Talaga, S., Epelboin, L., Dusfour, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus:+An+updated+review+of+competent+or+naturally+infected+mosquitoes.">Zika virus: An updated review of competent or naturally infected mosquitoes.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 11 (11), e0005933 (2017).</li><li>Aliota, M. T., Peinado, S. A., Osorio, J. E., Bartholomay, L. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence+of+French+Polynesian+Aedes+aegypti+and+Aedes+polynesiensis+for+Zika+Virus.">Vector Competence of French Polynesian Aedes aegypti and Aedes polynesiensis for Zika Virus.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (9), (2016).</li><li>Fortuna, C., Remoli, M. E., Di Luca, M., Severini, F., Toma, L., Benedetti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+studies+on+comparison+of+the+vector+competence+of+four+Italian+Culex+pipiens+populations+for+West+Nile+virus.">Experimental studies on comparison of the vector competence of four Italian Culex pipiens populations for West Nile virus.</a> Parasites &amp; Vectors. 8, 463 (2015).</li><li>Weger-Lucarelli, J., R&#252;ckert, C., Chotiwan, N., Nguyen, C., Garcia Luna, S. M., Turell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence+of+American+Mosquitoes+for+Three+Strains+of+Zika+Virus.">Vector Competence of American Mosquitoes for Three Strains of Zika Virus.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), (2016).</li><li>Dubrulle, M., Mousson, L., Moutailler, S., Vazeille, M., Failloux, A. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya+virus+and+Aedes+mosquitoes:+saliva+is+infectious+as+soon+as+two+days+after+oral+infection.">Chikungunya virus and Aedes mosquitoes: saliva is infectious as soon as two days after oral infection.</a> PLOS ONE. 4 (6), e5895 (2009).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

以前、古典の再給餌実験6に沿って強制唾液の分泌により得られた結果が示されています。ただし、両方で再実験を給餌、強制唾液分泌の提示手法じゃない直接唾液分泌活動を証明または唾液の放出を監視することが可能。唾液の分泌活動を証明する唾液に存在するその他のコンポーネント サンプルをテストでした (e.g。、蛋白質、炭水化物など。)。さらに、追加の qPCRs は、ウイルスの RNA のコピーの検出になります。これは、ただし、唾液のサンプル様々 な解析では、非常に低い粒子数の場合細胞培養の試金の感受性が制限される場合の分割が必要です。ターンでは、これは断固とした伝送レートの過小評価につながる可能性があります。
再現性のある結果を得るのため、実験終了時まで、すべての蚊が生き続けることを確認する必要です。これは蚊の身体運動活動を視覚的に監視することによって制御されます。さらに、与えられた蚊種の唾液分泌の試金の原則使用はコントロール ウイルスは、この特定の蚊種によって感染すると知られている供給によってテストされます。逆に、実験に導入されたすべてのウイルス感受性蚊でテストするがあります。
強制唾液分泌の試金には、多くの利点があります。蚊の高い数字は、基本制御の標準化された条件の下で単一の標本で動物福祉規則9と競合することがなく、同時にテストできます。
メソッドは、いくつかの研究所によって使用されます。ただし、研究室間の結果の違いにつながることができる正確なセットアップは異なる場合があります。1 つの重要なコンポーネントは、ガラス14またはプラスチック15の作ることができる唾液を収集するために毛細血管です。バイオ セーフティ レベル 3 横の高い安全基準を遵守するためフィルター チップの代わりに使ってガラス管、怪我のリスクを減らします。さらに、フィルターのヒントには、ピペットを使用して集められた液体を転送する簡単にことができます利点があります。
ここに示す強制唾液分泌の試金のセットアップは、連携して職務を共有研究者 2 名に基づいています。他は同時に強制唾液分泌のセットアップを準備している間、蚊の demobilizing は一人で行います。これは、大幅に処理時間を短縮し、リスクを最小限に抑えるサンプルのスイッチとして復員職場と流涎プレートの間を変更する必要はありません。さらに、復員直後後強制唾液デバイス蚊に置くことができます。この幾分短い蚊の処理時間は成功した強制唾液分泌に不可欠です。最後に、全体の実験中の蚊を直接監視できます。
ここで紹介唾液分泌の試金は、蚊のベクトル ポテンシャルに洞察力を得るために使用されます。ただし、いくつかの他の特定の質問に答える (e.g。、蚊に刺され脊椎動物に感染するために必要な数)、動物実験が必要な可能性があります。

フラビコロンビア、ブラジルに登場し、急速に広がったアメリカ大陸とカリブ海の間での注目すべき数字と流行を引き起こしてファミリーに属する蚊媒介ウイルス (mobovirus) の関連付けられたジカ (ZIKV)、2015 年に小頭症とギラン症候群の1症例ネッタイシマカとヒトスジシマカの種の蚊が ZIKV2のプライマリとセカンダリのベクトルと見なされますが、ヤブカ属の他の種がまた実験的ベクトル能力3 を持っている証明.ヤブカ属の種と対照をなしてこれまでテストアカイエカ種のほとんどはウイルス4を送信することがありません。単に、ネッタイイエカのデータは決定的な結果3を提供しました。現時点では、情報が欠けている蚊ベクトル能力 ZIKV の適当な温度条件の下で (< 20 ° C)。ただし、この情報は中央ヨーロッパなどの温帯気候地域に可能なスプレッドのリスク評価に実質的です。
ZIKV の有能なベクトル、取得、維持、増幅し、最後にウイルスを送信することができます。したがって、テスト蚊ボディまたはボディの部分、ZIKV の足、腸、頭や唾液腺を含むはありませんベクトル能力を決定するのに十分です。リリースされた唾液内の感染性ウイルス粒子をテストするは必須です。ベクトル能力を評価するために感染率 (IR, 吸血蚊の数 ZIKV 陽性蚊体数) と伝送速度 (トランジスタ、ZIKV 陽性 ZIKV 陽性蚊体の数で唾液で蚊の数)、する必要があります。決定されます。逆転写酵素実時間ポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR-RT) 続いて単に均質化蚊によって蚊の IRs を簡単に分析できる ZIKV を対象とします。さらに、感染症は、蚊あたりウイルス コピー数を決定することによってさらに特徴付けられます。対照的に、透過率の分析は、個々 の蚊の唾液中実行可能なウイルス粒子の検出に依存します。これは、ホスト5におけるウイルス血症の分析に続いて、感受性宿主動物に感染した蚊の餌によって達成することができます。ただし、このメソッドは適切なモデル生物に依存し、コストがかかり、動物福祉規則によって制限されています。伝送レートの分析に実験動物の使用を回避し、コストを削減するには、再供給システム人工血しぶきがされているを使用して記述されている6。しかし、高個体数と組み合わせて個々 のスケールのテストは難しいと時間がかかるです。個々 の規模の唾液分泌の試金の最初の説明が掲載されました 1966年7と強制の唾液分泌の実験、近年中に蚊3,8 のベクトル能力を評価するための最適な方法となっています。.
基づく中央ヨーロッパのベクトル能力研究蚊公開最近9、アンダーソンらによって報告された強制唾液分泌について述べる。8いくつかの変更。このメソッドにより、標準化高スループット高いバイオ セーフティ レベル条件 (BSL-3) 実験、細胞による培養の試金によってアクティブなウイルスの識別が含まれています。ここで説明した実験には、856 蚊が含まれます。ZIKV 人工吸血による感染、その後唾液で感染性のウイルス粒子の存在を分析します。実験で構成される 2 つの老舗実験Ae。 ネッタイシマカとチカイエカ アカイエカのバイオタイプチカイエカ(チカイエカ) としてフィールドの個体群に導入された蚊キャッチアカイエカアカイエカ アカイエカバイオタイプ アカイエカ (cx p. アカイエカ)、アカイエカ torrentium (cx torrentium)、2 つのAe。 ヒトスジシマカ集団。イタリアで収集された、2 つのAe。 ヒトスジシマカ集団の 1 つを除いてすべての蚊はドイツで収集されました。

<table><tbody><tr><td>Inject+matic Sleeper</td><td>Inject+matic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bugdorm-1 Insect Rearing Cage</td><td>BugDorm Store</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drosophila cultivation tubes</td><td>carl roth</td><td>PK11.2</td><td>plastic vial for mosquitoes</td></tr><tr><td>Plug for drosophila cultivation tubes</td><td>carl roth</td><td>PK15.1</td><td></td></tr><tr><td>Constant climate chamber</td><td>Binder</td><td>KBF-240</td><td></td></tr><tr><td>Blood</td><td></td><td></td><td>banked human blood, expired, not usable for medical application</td></tr><tr><td>Dumont-Pincette Electronic SS</td><td>Dumont</td><td>B40c</td><td></td></tr><tr><td>Vero cells</td><td>BNITM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flash light aspirator</td><td>Bioquip</td><td>2809</td><td></td></tr><tr><td>double-sided adhesive tape</td><td></td><td></td><td>no specific provider</td></tr><tr><td>Gammex Powder-free gloves with AMT</td><td>Ansell</td><td></td><td>for safety reasons necessary during work with pricks in the BSL3 laboratory</td></tr><tr><td>RealStar Zika Virus RT-PCR-Kit</td><td>altona diagnostics</td><td>591013</td><td></td></tr><tr><td>MagMax Pathogen RNA/DNA Kit</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>4462359</td><td>RNA isolation of mosquito bodies</td></tr><tr><td>Qiamp viral RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>52906</td><td>RNA-Isolation of supernatant</td></tr><tr><td>filter tips (20 &amp;micro;L)</td><td>Sarstedt</td><td>701,116,210</td><td>Cut the first 3 mm of the tip</td></tr><tr><td>hand motor mixer</td><td>carl roth</td><td>sold out</td><td></td></tr><tr><td>micro pestles for hand motor mixer</td><td>carl roth</td><td>CXH8.1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td>P0403550</td><td></td></tr><tr><td>L Glutamine Penicilin/Streptomycin</td><td>PAN</td><td>P0819100</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>PAN</td><td>P06-0110</td><td></td></tr><tr><td>Fructose</td><td>carl roth</td><td>4981.5</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>PAN</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>PAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvat</td><td>PAN</td><td>P0443100</td><td></td></tr><tr><td>MEM NAA</td><td>PAN</td><td>P0832100</td><td></td></tr><tr><td>Hemotek Feeder</td><td>Hemotek</td><td>PS6</td><td></td></tr><tr><td>Light Cycler</td><td>Roche</td><td>480 II</td><td></td></tr><tr><td>Light Cycler Software</td><td>Roche</td><td>480 SW 1.5.1</td><td></td></tr><tr><td>Modeling clay</td><td></td><td></td><td>no specific provider</td></tr><tr><td>King Fisher Flex Purification System</td><td>ThermoFisher scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Aedes albopictus&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>eggs were collected in Freiburg, Germany</td></tr><tr><td>Binocular</td><td>MOTIC</td><td>SMZ-168</td><td></td></tr><tr><td>Binocular light</td><td>MOTIC</td><td>MLC-150C</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-Incubator</td><td>Thermo scientific</td><td>MIDI 40</td><td></td></tr></tbody></table>

forced salivation as a method to analyze vector competence of mosquitoes

ベクトル能力は蚊種の脊椎動物のホストに蚊媒介ウイルス (mobovirus) を送信可能性として定義されます。実行可能なウイルス粒子は感染蚊の唾液を介して血液の食事中に送信されます。強制唾液分泌の試金は、動物実験の使用を避け、単一の蚊に基づくベクトル ポテンシャルの決定を許可します。メソッドは、時間の短い期間内に 1 つの実験で蚊の数が多いを分析に適しています。ドイツ、2 つの異なるを含むに閉じ込められた 856 個体を用い強制唾液分泌の試金チカイエカ アカイエカバイオタイプアカイエカ torrentiumとして感染したヒトスジシマカ、 ジカ ウイルス (ZIKV) および 18 ° C または 2 〜 3 週間の 27 ° C で培養。結果は、ZIKV の別のアカイエカ群のベクトル能力の欠如を示した。対照的に、ヒトスジシマカは 27 ° C、ネッタイシマカ研究所植民地を並行してテストに類似した伝送レートでしか ZIKV に感受性であった。

ネッタイシマカとして知られている有能なベクトル ZIKV の少なくとも12熱帯の気候条件の下で。したがって、我々 は肯定的な制御としてAe。 ネッタイシマカを使用アッセイを確立し、IRs として 27 ° C の孵化の温度、湿度 80% で TRs を分析します。IR と TR は、フォルトゥーナらによって前述したように定義されました。13。 挑戦Ae。 ネッタイシマカ50%、72% の IR と TR 42% と 31% 14, 21 日目にそれぞれ感染 (dpi) のポストを示した (図 1 aと1 b)。その後、欧州蚊 ZIKV 感染症、熱帯と温帯の気候条件を用いた伝送テストされています。
27 ° C の孵化の温度、すべて蚊種 14 dpi として 14 dpi のみで陽性であったcx p. アカイエカとcx torrentium個人以外の 21 dpi ZIKV 感染症を示した。ヤブカ属のすべての種がウイルス RNA 濃度が高いだけでなく、高い IRs (間 50%、72%) を示した (106 109 RNA コピー/蚊標本まで) 0 まで IRs、明らかに異なるアカイエカ群と比較して% 32% と 10 のウイルス負荷3 104 RNA コピー/蚊標本にします。アカイエカ群から唾液のサンプルのどれも ZIKV (図 1 aおよび1 b) に含まれるに対し、ヤブカ属のすべての種は ZIKV 陽性唾 (TR 13-42%) を表示されます。興味深いことに、21 dpi で伝送速度 (30%)、ドイツからAe。 ネッタイシマカとヒトスジシマカ Ae。類似していたが, 実質的にイタリアからヒトスジシマカ Ae。 (13%)。
低いウイルス負荷ヤブカ属種 (104– 106 RNA コピー/蚊) だけでなく別のアカイエカ群 (102-104、18 ° C の適当な温度で挑戦された蚊の孵化が一般に明らかにしました。RNA のコピー/蚊)。ただし、18 ° C の孵化の温度で ZIKV の伝送は観察されなかった, 蚊種のいずれかの.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57980/57980fig1.jpg"> 図 1: ZIKV 感染蚊の伝達率。別の蚊の種で ZIKV とベクトル能力研究の結果。分類群別の蚊 6 ZIKV に感染している、(B) の 21 日間または 14 (A) 18 ° C 27 ° C で培養しました。TR は、ZIKV 陽性 ZIKV 陽性蚊体の数で唾液で蚊の数として定義されます。蚊の調査の合計数は各時間のポイント/温度/蚊分類群の 30 人を最小限に抑えて、856 だった<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57980/57980fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

蚊のベクトル能力を分析する方法として唾液の分泌を強制

蚊媒介性ウイルス伝達の効率的な管理は、それぞれ蚊のベクトル ポテンシャルの知識が注目です。ヒトスジシマカと 3 異なるアカイエカ種はジカの伝達のためのベクトル能力を分析する方法として強制唾液分泌について述べる。

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...

forced-salivation-as-method-to-analyze-vector-competence

Research

JoVE Journal

Biology

9.5K ビュー.  Bernhard Nocht Institute for Tropical Medicine. 蚊媒介性ウイルス伝達の効率的な管理は、それぞれ蚊のベクトル ポテンシャルの知識が注目です。ヒトスジシマカと 3 異なるアカイエカ種はジカの伝達のためのベクトル能力を分析する方法として強制唾液分泌について述べる。

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Alphavirus Transducing System:  Tools for Visualizing Infection in Mosquito Vectors

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection. ATSs are derived from cDNA clones of mosquito-borne RNA viruses (genus Alphavirus; family Togaviridae). The Alphavirus genus contains about 30 different mosquito-borne virus species. Alphaviruses are enveloped viruses and contain single-stranded RNA genomes (~11.7 Kb). Alphaviruses transcribe a subgenomic mRNA that encodes the structural proteins of the virus required for encapsidation of the genome and maturation of the virus. Alphaviruses are usually highly lytic in vertebrate cells, but persistently infect susceptible mosquito cells with minimal cytopathology. These attributes make them excellent tools for gene expression in mosquito vectors. The most common ATSs in use are derived from Sindbis virus (SINV). The broad species tropism of SINV allows for infection of insect, avian, and mammalian cells8. However, ATSs have been derived from other alphaviruses as well9,10,20. Foreign gene expression is made possible by the insertion of an additional viral subgenomic RNA initiation site or promoter. ATSs in which an exogenous gene sequence is positioned 5' to the viral structural genes is used for stable protein expression in insects. ATSs, in which a gene sequence is positioned 3' to the structural genes, is used to trigger RNAi and silence expression of that gene in the insect.
ATSs have proven to be valuable tools for understanding vector-pathogen interactions, molecular details of viral replication and maintenance infectious cycles3,4,11,19,21. In particular, the expression of fluorescent and bioluminescent reporters has been instrumental tracking the viral infection in the vector and virus transmission5,14-16,18. Additionally, the vector immune response has been described using two strains of SINV engineered to express GFP2,9.
Here, we present a method for the production of SINV containing a fluorescent reporter (GFP) from the cDNA infectious clone. Infectious, full-length RNA is transcribed from the linearized cDNA clone. Infectious RNA is introduced into permissive target cells by electroporation. Transfected cells generate infectious virus particles expressing the GOI. Harvested virus is used to infect mosquitoes, as described here, or other host species (not shown herein). Vector competence is assessed by detecting fluorescence outside the midgut or by monitoring virus transmission7. Use of a fluorescent reporter as the GOI allows for convenient estimation of virus spread throughout a cell culture, for determination of rate of infection, dissemination in exposed mosquitoes, virus transmission from the mosquito and provides a rapid gauge of vector competence.

Methods for using alphavirus transducing systems to express fluorescent reporters in vitro and in adult mosquitoes are described. This technique may be adapted to express any protein of interest in lieu of or in addition to a reporter.

アルファウイルス形質導入システム：蚊で感染を可視化するためのツール

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection.  ATSs are derived from cDNA clones of ...

免疫・感染学

Reproducible dsRNA Microinjection and Oviposition Bioassay in Mosquitoes and House Flies

Synthetic dsRNAs, used to induce RNA interference, may have dose dependent phenotypic effects. These effects are difficult to define if the dsRNAs are delivered using a non-quantitative method. Accurate delivery of known quantities of nucleic acids or other chemicals is critical to measure the efficacy of the compound being tested and to allow reliable comparison between compounds.
Here we provide a reproducible, quantitative microinjection protocol that ensures accurate delivery of specific doses of dsRNA, reducing the mortality typically induced by injection injury. These modifications include the addition of Rhodamine B, a graduated injection needle, and an improved recovery method borrowed from Isoe and Collins. This method allows calculation of dose responses and facilitates comparisons between compounds. Versions of this method have been successfully used on three genera of mosquitoes as well as house flies to assess the reduction in fecundity resulting from gene silencing of ribosomal RNA transcripts.
This protocol provides strategies to reduce several challenges of small insect microinjection. Together, mechanical delivery of dsRNAs accompanied by visual verification, identification of effective locations for delivery, and inclusion of a post-injection recovery period ensure accurate dosing and low injury mortality. This protocol also describes an oviposition bioassay for uniform determination of effects on fecundity.

This protocol describes a microinjection methodology that we have standardized and used for several years to deliver specific quantities of nucleic acids directly to the hemolymph of mosquitoes and house flies. This protocol results in minimal injection mortality and allows dose correlated measurements of fecundity.

再現可能な dsRNA のインジェクションと蚊とハエの産卵生物検定

Synthetic dsRNAs, used to induce RNA interference, may have dose dependent phenotypic effects. These effects are difficult to define if the dsRNAs are ...

環境学

Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae

In vivo microinjection is the most commonly used gene transfer technique for analyzing the gene functions in individual mosquitoes. However, this method requires a more technically demanding operation and involves complicated procedures, especially when used in larvae due to their small size, relatively thin and fragile cuticle, and high mortality, which limit its application. In contrast, viral vectors for gene delivery have been developed to surmount extracellular and intracellular barriers. These systems have the advantages of easy manipulation, high gene transduction efficiency, long-term maintenance of gene expression, and the ability to produce persistent effects in vivo. Mosquito densoviruses (MDVs) are mosquito-specific, small single-stranded DNA viruses that can effectively deliver foreign nucleic acids into mosquito cells; however, the replacement or insertion of foreign genes to create recombinant viruses typically causes a loss of packaging and/or replication abilities, which is a barrier to the development of these viruses as delivery vectors.
Herein, we report using an artificial intronic small-RNA expression strategy to develop a non-defective recombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo delivery system. Detailed procedures for the construction, packaging and quantitative analysis of the rAaeDV vectors, and for larval infection are described.
This study demonstrates, for the first time, the feasibility of developing a non-defective recombinant MDV micro RNA (miRNA) expression system, and thus providing a powerful tool for the functional analysis of genes in mosquito and establishing a basis for the application of viral paratransgenesis for controlling mosquito-borne diseases. We demonstrated that Aedes albopictus 1st instar larvae could be easily and effectively infected by introducing the virus into the water body of the larvae breeding site and that the developed rAaeDVs could be used to overexpress or knock down the expression of a specific target gene in larvae, providing a tool for the functional analysis of mosquito genes.

We report using an artificial intronic small RNA expression strategy to develop a non-defective recombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo delivery system. A detailed procedure for the construction, packaging, and quantitative analysis of the rAaeDV vectors as well as for larval infection is described.

蚊幼虫における遺伝子の機能解析の遺伝子配達ベクトルとして組換え蚊 Densovirus を使用

In vivo microinjection is the most commonly used gene transfer technique for analyzing the gene functions in individual mosquitoes. However, this method ...

発生生物学

Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response

The stimulation of immune responses is a common tool in invertebrate studies to examine the efficacy and the mechanisms of immunity. This stimulation is based on the injection of non-pathogenic particles into insects, as the particles will be detected by the immune system and will induce the production of immune effectors. We focus here on the stimulation of the melanization response in the mosquito Anopheles gambiae. The melanization response results in the encapsulation of foreign particles and parasites with a dark layer of melanin. To stimulate this response, mosquitoes are inoculated with beads in the thoracic cavity using microcapillary glass tubes. Then, after 24 hr, the mosquitoes are dissected to retrieve the beads. The degree of melanization of the bead is measured using image analysis software. Beads do not have the pathogenic effects of parasites, or their capacity to evade or suppress the immune response. These injections are a way to measure immune efficacy and the impact of immune stimulations on other life history traits, such as fecundity or longevity. It is not exactly the same as directly studying host-parasite interactions, but it is an interesting tool to study immunity and its evolutionary ecology.

Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response

Through inoculation with beads, the described technique enables the stimulation of the mosquito melanization response in the hemolymph circulating system. The amount of melanin covering the beads can be measured after dissection as a measure of the immune response.

接種<em&gt;ハマダラカ</emメラニン免疫応答を誘導し、測定するためにビーズと&gt;蚊

The stimulation of immune responses is a common tool in invertebrate studies to examine the efficacy and the mechanisms of immunity. This stimulation is ...

Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. However, effective malaria parasite targets for vaccine and chemotherapy development are still limited. This is largely due to the unavailability of relevant and practical in vivo infection models for human Plasmodium species, most notably for P.&#160;falciparum and P. vivax. Therefore, rodent malaria species have been extensively used as practical alternative in vivo models for malaria vaccine, drug targeting, immune response, and functional characterization studies of conserved Plasmodiumspp. genes. Indeed, rodent malaria models have proven to be invaluable, especially for exploring mosquito transmission and liver stage biology, and were indispensable for immunological studies. However, there are discrepancies in the methods used to evaluate the phenotypes of transgenic and wild-type asexual and sexual blood-stage parasites.&#160;Examples of these discrepancies are the choice of an intravenous vs. intraperitoneal infection of rodents with blood-stage parasites and the evaluation of male gamete exflagellation. Herein, we detail standardized experimental methods to evaluate the phenotypes of asexual and sexual blood stages in transgenic parasites expressing reporter-gene or wild-type rodent malaria parasite species. We also detail the methods to evaluate the phenotypes of malaria parasite mosquito stages (gametes, ookinetes, oocysts, and sporozoites) inside Anopheles mosquito vectors. These methods are detailed and simplified here for the lethal and non-lethal strains of P. berghei and P. yoelii but can also be applied with some adjustments to P. chabaudi and P. vinckei rodent malaria species.

Due to the striking similarities of the life cycle and biology of rodent malaria parasites to human malaria parasites, rodent malaria models have become indispensable for malaria research. Herein, we standardized some of the most important techniques used in the phenotypic analysis of wild-type and transgenic rodent malaria species.

げっ歯類マラリア寄生虫の現象分析無性および性的血液段階と蚊の段階

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

ジカウイルスを用いた Aedes aegypti蚊の ベクターコンピテンス分析

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public health. Once ingested, the viruses must overcome the mosquito midgut barrier to reach the hemolymph, from where they might potentially spread to the salivary glands. When a mosquito bites, these viruses are spread to new vertebrate hosts. Similarly, the mosquito may pick up different viruses. In general, only a tiny portion of viruses may enter the salivary glands via the gut. The transmission efficiency of these viruses to the glands is be affected by the two physical barriers found in different mosquito species: midgut barriers and salivary glands barriers. This protocol presents a method for virus detection in salivary glands of Aedes aegypti&#39;s&#160;following oral feeding and intrathoracic injection infection. Furthermore, determining whether the guts and/or salivary glands hinder viral spread can aid in the risk assessments of MBVs transmitted by Aedes aegypti.

This methodology, which included oral feeding and intrathoracic injection infection, could effectively assess the influence of midgut and/or salivary gland barriers on arbovirus infection.

経口摂食とマイクロインジェクションによる成体蚊の実験的ウイルス感染

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...

Effective Oral RNA Interference (RNAi) Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) administration has been accomplished primarily via injection, which requires significant time and is not suitable for field applications. To overcome these limitations, here we present a more efficient method for robust activation of RNAi by oral delivery of dsRNA to adult Anopheles gambiae. Long dsRNAs were produced in Escherichia coli strain HT115 (DE3), and a concentrated suspension of heat-killed dsRNA-containing bacteria in 10% sucrose was offered on cotton balls ad-libitum to adult mosquitoes. Cotton balls were replaced every 2 days for the duration of the treatment. Use of this method to target doublesex (a gene involved in sex differentiation) or fork head (which encodes a salivary gland transcription factor) resulted in reduced target gene expression and/or protein immunofluorescence signal, as measured by quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) or fluorescence confocal microscopy, respectively. Defects in salivary gland morphology were also observed. This highly flexible, user-friendly, low-cost, time-efficient method of dsRNA delivery could be broadly applicable to target genes important for insect vector physiology and beyond.

Effective Oral RNA Interference RNAi Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

The oral administration of dsRNA produced by bacteria, a delivery method for RNA interference (RNAi) that is routinely used in Caenorhabditis elegans, was successfully applied here to adult mosquitoes. Our method allows for robust reverse genetics studies and transmission-blocking vector studies without the use of injection.

成虫 のアノフェレスガンビアエ 蚊への効果的な経口RNA干渉(RNAi)投与

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) ...

生物学

Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. Insecticide resistance surveillance of mosquito populations is typically done through Centers for Disease Control and Prevention (CDC) bottle bioassays or World Health Organization (WHO) tube tests. However, these methods can result in a high degree of variability in mortality data due to variable insecticide contact with&#160;the insect, the relatively small numbers of organisms tested, extensive variation in mass between populations, and constantly changing environmental conditions, leading to variable outcomes. This paper presents the topical application bioassay, adapted as a high-throughput phenotypic bioassay for both mosquitoes and fruit flies, to test large numbers of insects along&#160;a range of insecticide concentrations.
This assay 1) ensures consistent treatment and insecticide contact with every organism, 2) produces highly specific dose-response curves that account for differences in average mass between strains and sexes (which is particularly important for field-collected organisms), and 3) allows for the calculation of statistically rigorous median lethal doses (LD50), which are necessary for resistance ratio comparisons-an alternative surveillance approach from diagnostic dose mortality, which is also used for larvicide resistance surveillance. This assay will be a complementary tool for accurately phenotyping mosquito populations and, as illustrated using fruit flies, is easily adaptable for use with other insects. We argue that this assay will help fill the gap between genotypic and phenotypic insecticide resistance in multiple insect species.

We describe the methodology and importance of the topical application bioassay to measure insecticide susceptibility in mosquitoes and fruit flies. The presented assay is high-throughput, utilizes insect mass-thus allowing for calculating a mass-relativized lethal dose instead of concentration-and likely has lower variability than other similar methods.

蚊やショウジョウバエに対する殺虫剤毒性を定量するための局所適用バイオアッセイ

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. ...

Topical Testing Assay: A Technique to Evaluate the Insecticidal Potential of Dopamine Receptor Antagonists on Adult Female Mosquitoes by Topical Application

Culture 3 to 5-day-old adult female mosquitoes in a 20-liter plastic cage. Label 9-ounce paper cups with the name and concentration of testing compound.
Next, prepare a 10 &#181;g/&#181;L stock solution of the testing compound in acetone in a 20-milliliter glass vial. Then, serially dilute the stock solution to obtain the desired working concentrations.
Clean a 1-milliliter glass syringe with acetone, and then, fill it with the test solution at the appropriate concentration. Secure the syringe in a micro-applicator, adjusted to deliver a volume of 0.25 microliters.
Next, use an aspirator to remove ten 3 to 5-day-old adult female mosquitoes from the cage, and anesthetize them for 5 minutes at 4 degrees Celsius. Then, transfer the mosquitoes to a Petri dish, and place the dish on ice for 10 minutes.
In order to avoid damaging the adult mosquito, which could contribute to mortality, ensure that they are not anesthetized in the fridge for more than 5 minutes, or immobilized on ice for more than 10, and minimize the handling of the mosquitoes. If you have access to a cold plate and a micromanipulator with a movable stage, that may further minimize handling of the mosquitoes.
Use fine tweezers to remove each mosquito from the dish. With the syringe micro-applicator, apply 0.25 microliters of testing solution to the dorsal thorax under a dissecting microscope. Next, transfer the mosquitoes to a labeled paper cup on ice. Seal the cup with a 10 by 10-centimeter mesh square, and a rubber band. Then, transfer it to the growth chamber, and record the number of dead mosquitoes.

蚊のベクトル能力を分析する方法として唾液の分泌を強制

要約

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アルファウイルス形質導入システム：蚊で感染を可視化するためのツール

再現可能な dsRNA のインジェクションと蚊とハエの産卵生物検定

蚊幼虫における遺伝子の機能解析の遺伝子配達ベクトルとして組換え蚊 Densovirus を使用

接種

げっ歯類マラリア寄生虫の現象分析無性および性的血液段階と蚊の段階

ジカウイルスを用いた Aedes aegypti蚊のベクターコンピテンス分析

経口摂食とマイクロインジェクションによる成体蚊の実験的ウイルス感染

成虫のアノフェレスガンビアエ蚊への効果的な経口RNA干渉(RNAi)投与

蚊やショウジョウバエに対する殺虫剤毒性を定量するための局所適用バイオアッセイ

局所検査アッセイ:局所適用による成虫の雌蚊に対するドーパミン受容体拮抗薬の殺虫性の可能性を評価する技術

蚊のベクトル能力を分析する方法として唾液の分泌を強制

要約

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アルファウイルス形質導入システム：蚊で感染を可視化するためのツール

再現可能な dsRNA のインジェクションと蚊とハエの産卵生物検定

蚊幼虫における遺伝子の機能解析の遺伝子配達ベクトルとして組換え蚊 Densovirus を使用

接種

げっ歯類マラリア寄生虫の現象分析無性および性的血液段階と蚊の段階

ジカウイルスを用いた Aedes aegypti蚊の ベクターコンピテンス分析

経口摂食とマイクロインジェクションによる成体蚊の実験的ウイルス感染

成虫 のアノフェレスガンビアエ 蚊への効果的な経口RNA干渉(RNAi)投与

蚊やショウジョウバエに対する殺虫剤毒性を定量するための局所適用バイオアッセイ

局所検査アッセイ:局所適用による成虫の雌蚊に対するドーパミン受容体拮抗薬の殺虫性の可能性を評価する技術

ジカウイルスを用いた Aedes aegypti蚊のベクターコンピテンス分析

成虫のアノフェレスガンビアエ蚊への効果的な経口RNA干渉(RNAi)投与