RNA干渉は、蚊の逆遺伝学に使用される主なツールの1つであり、経口送達により、マイクロ注射を必要とせずに成虫の蚊の遺伝子サイレンシングを誘導および維持することができます。成虫の蚊への二本鎖RNAの経口送達は、低コストで汎用性の高いRNA干渉法であり、遺伝子機能を研究するための作業と時間と労力を大幅に削減します。この方法は、Anopheles gambiaeの他の標的遺伝子だけでなく、Anopheles albinamusのような関心のある別のアノフェレスでも研究するために使用することができる。
まず、アンピシリンおよびテトラサイクリンを含む5ミリリットルのlbで二本鎖RNA発現プラスミドを含むエシェリヒア・コリ株HT115(DE3)の単一細菌コロニーからの培養物をプラットフォームシェーカー上で37°Cおよび180RPMで12時間増殖させる。12時間後、一晩増殖した細菌培養物の0.5ミリリットルを取り、アンピシリンおよびテトラサイクリンを含む2X酵母トリプトン培地で1000分の1希釈液を作る。二本鎖RNA産生を誘導するために、IPDGを終濃度40マイクロモルで加える。
次いで、実証されたように振とう条件下で培養物を2時間インキュベートする。培養物の光学密度が600ナノメートルで0.4に達したときの培養の終わりに、4°Cで10分間、4,000倍Gで遠心分離することによって細菌細胞をペレット化し、次いで細胞を1容量のPBSで洗浄する。細胞をもう一度回転させた後、細胞をPBSに再懸濁し、摂氏70度で1時間インキュベートする。
バクテリアを熱死させた後、400マイクロリットルの量のアリコートを作り、さらに使用するまで摂氏20度で保管してください。二本鎖RNAを発現する解凍熱死菌の400マイクロリットルのアリコート1個と、0.2%メチルパラベンを含む1.6ミリリットルの12%糖溶液とを混合する。この溶液に小さな綿球を浸し、5日齢の蚊を含むケージに入れ、蚊がこの溶液を食べることを確認します。
二本鎖RNA糖液に浸した綿球を1日おきに8日間連続して交換し、ケージが一定の条件下で維持されるようにする。蚊を寒さで麻酔するには、蚊が動きを止めるまで容器を氷の上に置き、蚊を冷たい表面に置いて解剖のために女性を隔離します。蚊にエタノールを噴霧した後、PBSでガラス表面に置きます。
一対の鉗子で、蚊の頭を固定し、胸郭を非常にゆっくりと引っ張り、唾液腺をPBSに放出させる。唾液腺を10匹の蚊から解剖したら、RNA抽出のために腺を引っ張ります。RNA抽出が完了したら、RNAペレットを30マイクロリットルのRNA遊離水に懸濁する。
吸光度を測定し、テキスト原稿に記載されているようにRNA濃度を計算します。市販の逆転写キットを用いて、1マイクログラムのRNAからcDNAを合成する。cDNAを10倍希釈し、製造業者の推奨に従って、標的遺伝子およびハウスキーピング遺伝子についてRTPCR反応を3連でセットアップする。
標準的なリアルタイムPCR条件でCDNAを増幅する。血液供給能力を評価するために、標的および制御された二本鎖RNAで処理された15匹の雌の蚊のグループを小さなケージに入れ、それらを4時間飢えさせる。摂氏37度に設定された循環水浴、ガラスの蚊の餌箱、およびペリフィル膜を使用して、除細動した安価な血液を蚊に提供します。
各グループで完全に充血するために、最初の5人の女性から血液の食事を首尾よく獲得するためのプロービング試行の数を観察し、数え、記録します。新鮮な組織およびPBSを単離した後、以前に実証した、氷冷アセトン中で90秒間固定する。その後、PBSで組織を数回すすぎ、PBSで希釈した抗血清と共に摂氏4度で一晩一次抗体と共にインキュベートする。
インキュベーションの終わりに、PBSで組織を数回洗浄する。PBSで希釈した蛍光二次抗体を加え、室温で暗所で2時間インキュベートした。2時間インキュベーションの終了の30分前に任意のカウンター染色剤を加える。
2時間後、PBSで組織を3回洗浄し、次いで100%グリセロール中の組織を厚さ1ミリメートルのカバースリップを備えた標準的な顕微鏡スライド上にマウントし、イメージングまで摂氏20度で保存する。マイクロアレイ発現データは、成体唾液腺における選択されたすべての標的遺伝子の発現を示し、AAPおよびセージのレベルは特に高かった。二本鎖RNAは、唾液腺におけるフォークヘッド転写物の存在量を効果的に減少させた。
フォークヘッド二本鎖RNA給餌蚊は、対照群またはFEG二本鎖RNA給餌蚊よりも5倍多くの摂食試行を示し、蚊は完全に血液で充血した。セージおよびCrebA染色のレベルは、アリ対照RNA干渉と比較して、フォークヘッドRNA干渉後のすべての唾液腺葉において顕著に減少した。非常に豊富な唾液成分タンパク質を考慮すると、対照RNA干渉処理と比較して、フォークヘッドRNA干渉後の3つの唾液腺葉すべてにおいてAPPのレベルが低下した。
一方、ムチンのレベルに変化は認められなかった。これらのデータは、フォークヘッドが異なる唾液タンパク質遺伝子の発現に異なる方法で寄与することを示唆している。フォークヘッドRNA干渉処理後の遠位側葉ではRab11蛍光の減少が観察されたが、内側および近位側葉におけるRab11シグナルの増加も起こった。
フォークヘッドRNA干渉後のナイルレッドシグナルには、対照RNA干渉処理と比較して識別可能な差は観察されなかった。唾液腺葉間で異なる複雑な方法でのいくつかの秘書機械反応。この技術により、研究者は二本鎖RNAの単回注射によって発現を低下させることができる遺伝子を沈黙させ、RNAiを潜在的なベクター制御方法として使用するために二本鎖RNAの経口送達を探索することができる。
