Wir bedanken uns bei Ella Weinert, Michelle Helms und Marlis Badusche für hervorragende technische Unterstützung, Jessica Börstler für Analysen von Culex -Mücken, Norbert Becker und Björn Pluskota für die Bereitstellung von Aedes Albopictus Eier und Olli Vapalahti für Bereitstellung den Virus bestand. ML wurde von der Leibniz-Gemeinschaft unterstützt; Nummer Säge-2014-SGN-3 zu gewähren.

1. bereiten Sie weibliche Stechmücken
<ol><li>Sammeln Sie Mücken aus ein großer Käfig mit einer Absauganlage (ca. 400 Mücken pro großer Käfig).</li>
	<li>Betäuben Sie die Mücken mit Kohlendioxid (CO2) für 7 s.</li>
	<li>Sortieren Sie 20 Weibchen pro Kunststoff Vial (Ø 50 mm × 100 mm). Hinweis: Wenn die Mücken aufwachen, verwenden Sie weitere 3 s Co2.
</li>
	<li>Verhungern Sie die Mücken über Nacht.</li>
</ol>2. künstliche Blutmahlzeit
Hinweis: Alle Schritte sind unter BSL-3 Bedingungen durchgeführt.
<ol><li>
Bereiten Sie die infektiöse Blutmahlzeit.
	<ol>
<li>Verdünnen Sie den Virus bestand, die Konzentration von 1 x 108 Plaque bilden Einheiten (PFU) / mL. Hinweis: Die Lager Konzentration wurde bestimmt durch Gewebekultur Infektion Dosis 50-Methode (TCID50) ausführen und berechnet, indem die Spearman & Kärber Algorithmus10,11.</li>
		<li>Mix abgelaufen menschliches Blut (Blut-Erhaltung) von der Blutbank (nicht geeignet für Menschen mehr, aber nützlich für die Mücken) mit Fruchtzucker (8 % ige Lösung), filtriert, bovine Serum (FBS) und funktionierende Lösung des Bestands Virus (menschliches Blut: Fruktose: FBS abgelaufen: Arbeitslösung = 5:3:1:1). Hinweis: Wir entschieden uns für menschliches Blut, denn dies ist der bekannte natürliche Säugetier-Gastgeber des ZIKV.</li>
	</ol>
</li>
	<li>140 µL Blutmahlzeit Mix zur weiteren Analyse über TCID50 einfrieren.</li>
	<li>
Führen Sie die künstliche Ernährung mit verschiedenen Fütterung Methoden, abhängig von der Sorte:
	<ol>
<li>
Aedes Aegypti: verwenden eine Membran Fütterungssystem für 30 min (1 mL pro Feeder).</li>
		<li>
Culex spp.: bieten die ansteckende Blut über ein Wattestäbchen über Nacht und nicht das Blut (300 µL pro Fläschchen) Aufwärmen.</li>
		<li>
Aedes Albopictus: zwei Tropfen (50 µL) der Blutmahlzeit Mischung in die Kunststoff-Flasche und lassen die Moskitos für 2 h füttern. Das Blut nicht Aufwärmen. Hinweis: Die Mücken werden in den ersten 15 min einfließen. Die längeren Inkubationszeit ist aus Sicherheitsgründen notwendig. Die Tröpfchen Blut abgelassen nach 2 h, damit das Kontaminationsrisiko reduziert wird, während die Sortierung der Mücken gefüttert.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Betäuben Sie die Mücken mit CO2 für 7 s. Hinweis: Wenn die Mücken aufwachen, verwenden Sie weitere 3 s CO2.</li>
	<li>Art und Anzahl voll gestaut Mücken in ein neues Fläschchen.</li>
	<li>Fügen Sie ein Wattepad, gesättigt mit Fruchtzucker (8 % ige Lösung) zwischen das Fläschchen und ein Stecker.</li>
	<li>Halten Sie die Mücken an der vorgesehenen Temperatur von 18 ° C und 27 ° C in der Luftfeuchtigkeit von 80 % für 14 oder 21 Tage.</li>
	<li>Füttern Sie die Mücken mit Fruktose gesättigte Wattepads. Alle 72 h mit Fruktose (8 % ige Lösung) pro Fläschchen 1,5 mL Auffüllen (bis zu 20 Mücken, abhängig von der Fütterung bewerten, siehe Punkt 2.5).</li>
</ol>(3) gezwungen Speichelfluss Assay an Tag 14 oder 21
Hinweis: Alle Schritte sind unter BSL-3 Bedingungen durchgeführt.
<ol><li>2 x 104 Vero-Zellen Seed / pro Bohrloch in ein 96 sowie Platte mit 200 µL Wachstumsmedium (Dulbecco´s modifiziert Eagle Medium (DMEM) mit 3 % FBS, 100 U/mL Penicillin, 100 mg/mL Streptomycin, 5 µg/mL Amphotericin B, 2 mM L-Glutamin ergänzt 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA), 1 % Natrium Pyruvat).</li>
	<li>
Bereiten Sie das Speichelfluss-Gerät:
	<ol>
<li>Legen Sie eine quadratische Glasplatte (20 × 20 cm) auf der Bank in einem Winkel von 30°. Hinweis: Dies ist notwendig, da der Unterdruck im Sicherheitslabor. Wenn die Platte horizontal oder vertikal, wird Flüssigkeit austreten.</li>
		<li>Legen Sie doppelseitiges Klebeband auf die Glasplatte.</li>
		<li>Rolle der Modelliermasse bis es erreicht einen Durchmesser von 0,5 cm und horizontal 1 cm entfernt von dem doppelseitigen Klebeband befestigen.</li>
		<li>Die ersten 0,3 cm von der Spitze der eine 10 µL Filterspitze abgeschnitten. Hinweis: Es empfiehlt sich, dies vor Beginn des Experiments außerhalb des Biosafety Labors vorzubereiten.</li>
		<li>Füllen Sie die Filter-Tips mit 10 µL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4).</li>
		<li>Legen Sie die Filter-Tips auf die Modelliermasse mit der Spitze in Richtung der Klebeband.</li>
		<li>Sichern Sie die Filter-Tips mit sanftem Druck.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bereiten Sie die Mücken:
	<ol>
<li>Die Mücken mit CO2zu betäuben.</li>
		<li>Entfernen Sie die Beine und Flügel, die Mücken zu immobilisieren.</li>
		<li>Befestigen Sie die Mücke lebenden Körper auf Klebeband über eine Filterspitze.</li>
		<li>Legen Sie den Rüssel sanft in die Filterspitze.</li>
		<li>Laufen Sie den Speichelfluss Test für 30 min.</li>
		<li>Entfernen Sie die Filter-Tips und entsorgen Sie der Lehm und Band.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Verarbeitung von Speichel
Hinweis: Schritte 4.1 – 4.6.2 sind unter BSL-3 Bedingungen durchgeführt.
<ol><li>Vertreiben Sie den Inhalt in die Reaktionsgefäße mit 10 µL PBS.</li>
	<li>Mischen Sie vorsichtig und übertragen Sie die Inhalte in die Vertiefungen der vorbereiteten 96-well-Platte mit einem Brunnen pro Probe.</li>
	<li>7 Tage bei 37 ° C mit 5 % CO2inkubieren Sie Platte.</li>
	<li>Verwenden Sie das Fernglas, um die Zellen auf das Vorhandensein von Zytopathischer Effekt (CPE) überprüfen.</li>
	<li>Wenn die nun positiv für CPE, Ernten des Überstands durch pipettieren 140 µL in einem Reaktionsgefäß für RNA-Extraktion.</li>
	<li>
Reinigen Sie die RNA mittels einer RNA-Extraktion-Kit.
	<ol>
<li>Mix-140 µL des Überstands mit 560 µL AVL Puffer (virale Lyse Puffer) und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
		<li>Hinzufügen von 560 µL Ethanol (96 %) und Wirbel der Probe. Hinweis: Die Proben sind nach diesem Schritt deaktiviert und aus dem Labor BSL-3 abgeführt werden können.</li>
		<li>Pipettieren 630 µL der Probe auf eine Spalte und Zentrifuge mit 6.000 x g für 1 min.</li>
		<li>Verwerfen Sie das Filtrat, pipettieren der verbleibenden 630 µL auf die Spalte zu und wiederholen Sie die Zentrifugation.</li>
		<li>Waschen der RNS, gebunden an die Membran der Spalte, durch Zugabe von 500 µL Waschpuffer 1 Spalte und Zentrifuge bei 6.000 X g für 1 min.</li>
		<li>Entsorgen Sie das sammelröhrchen und legen Sie die Spalte in eine neue Kollektion-Röhre. Fügen Sie 500 µL waschen Puffer 2 und Zentrifuge bei 12.500 X g für 3 min.</li>
		<li>Entsorgen Sie das sammelröhrchen und legen Sie die Spalte in einem 1,5 mL Reaktionsgefäß.</li>
		<li>Fügen Sie 50 µL der Elution Buffer und 1 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
		<li>Bei 6.000 X g für 1 min zentrifugieren Sie und verwerfen Sie die Spalte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Proben für ZIKV RNA durch RT-qPCR analysieren.</li>
</ol>5. Bearbeitung von Mosquito Körper
Hinweis: Die Schritte 5.1-5.5 sind unter BSL-3 Bedingungen durchgeführt.
<ol><li>Entfernen Sie der Körper des Moskitos und jeder Körper in einem Reaktionsgefäß. Hinweis: Es ist möglich, das Experiment zu diesem Zeitpunkt anhalten und speichern die Proben bei-80 ° C.</li>
	<li>Fügen Sie 500 µL der Homogenisierung Medien (DMEM ohne irgendwelche Nahrungsergänzungsmittel) in das Reaktionsgefäß.</li>
	<li>Homogenisieren Sie den Körper mit motor Handmixer zu und verwenden Sie einen neuen Stempel für jede Probe.</li>
	<li>Fügen Sie 200 µL Das Homogenat in eine 96-Well-Platte für die Reinigung. Hinweis: Es ist möglich, das Experiment zu diesem Zeitpunkt anhalten und speichern die Proben bei-80 ° C.</li>
	<li>Deaktivieren Sie die Platte durch Inkubation für 60 min bei 60 ° C.</li>
	<li>Reinigen Sie die RNA durch automatisierte Nukleinsäure-Reinigung. Hinweis: Es ist möglich, das Experiment zu diesem Zeitpunkt anhalten und speichern die Proben bei-80 ° C.</li>
</ol>6. Analyse
<ol><li>Die virale RNA-Kopien mit RT-qPCR zu quantifizieren. Hinweis: Die RNA-Kopien wurden gemittelt über alle ZIKV-positiven Moskito Körper und ohne Einbeziehung der ZIKV-Negative Mücken.</li>
	<li>Berechnen Sie die IR, definiert als die Anzahl der ZIKV-positiven Moskito Körper pro Anzahl der Weibchen gefüttert.</li>
	<li>TR, definiert als die Anzahl der Mücken mit ZIKV-positiven Speichel pro Anzahl der ZIKV-positiven Moskito Körper zu berechnen. Die Übertragungsrate konnte nicht für Arten-Temperatur-Kombinationen mit keine ZIKV-positiven Körper berechnet werden.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Musso, D., Gubler, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus.">Zika Virus.</a> Clinical Microbiology Reviews. (3), 487-524 (2016).</li><li>Epelboin, Y., Talaga, S., Epelboin, L., Dusfour, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus:+An+updated+review+of+competent+or+naturally+infected+mosquitoes.">Zika virus: An updated review of competent or naturally infected mosquitoes.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 11 (11), e0005933 (2017).</li><li>Aliota, M. T., Peinado, S. A., Osorio, J. E., Bartholomay, L. 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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Bisher hat sich gezeigt, dass klassische neu Fütterung Experimente6Ergebnisse mit erzwungenen Speichelfluss entsprechen. Jedoch ist wieder Fütterungsversuche sowohl in unsere vorgestellte Methode der erzwungenen Speichelfluss, es unmöglich, direkt Nachweis Speichelfluss Aktivität oder die Freisetzung von Speichel zu überwachen. Um Speichelfluss Aktivität zu beweisen, konnte Proben getestet werden, für andere Komponenten im Speichel vorhanden (zB., Proteine, Kohlenhydrate, etc..). Darüber hinaus könnten zusätzliche qPCRs Nachweis von viraler RNA-Kopien. Dies erfordert allerdings, Spaltung der Speichelproben für verschiedene Analysen, die Empfindlichkeit in der Zelle Kultur Test bei sehr niedrigen Partikelanzahl begrenzen können. Im Gegenzug könnte dies zu einer Unterschätzung des ermittelten Übertragungsraten.
Um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen ist es notwendig, um sicherzustellen, dass alle Mücken bis zum Ende des Experiments am Leben zu bleiben. Dies wird gesteuert, indem Sie visuell überwachen den Körper Bewegungsaktivität der Moskitos. Darüber hinaus hat die Prinzip Verwendung des Speichelfluss Assays für einen bestimmten Mückenarten getestet werden, durch die Fütterung von Kontrolle-Viren, die bekannt sind, durch diese bestimmte Mückenarten übertragen werden. Umgekehrt, hat jeder Virus erstmals in einem Experiment in einer anfälligen Mücke getestet werden.
Erzwungene Speichelfluss Assays haben viele Vorteile. Hohe Anzahl von Mücken können gleichzeitig auf einem einzigen Exemplar unter kontrollierten standardisierten Bedingungen getestet werden, ohne dass Konflikte mit Tierschutz Vorschriften9.
Die Methode wird von mehreren Labors verwendet. Genaue Einstellungen können jedoch abweichen, um Unterschiede in den Ergebnissen zwischen den Labors führen kann. Eine wichtige Komponente ist die Kapillare, den Speichel zu sammeln, die von Glas14 oder Kunststoff15erfolgen kann. Zur Einhaltung der hohen Sicherheitsbestimmungen ein Biosafety Level 3 Insectary benutzten wir Kunststoff Filterspitzen anstelle von Glaskapillaren, wodurch das Risiko von Verletzungen. Filter-Tips haben darüber hinaus den Vorteil, dass die gesammelte Flüssigkeit mit einer Pipette leicht übertragen werden kann.
Das Setup des hier vorgestellten erzwungene Speichelfluss Assays beruht auf zwei Ermittler arbeiten zusammen und teilen Aufgaben. Demobilisierung der Mücke wird von einer Person durchgeführt, während die andere gleichzeitig das erzwungene Speichelfluss Setup bereitet. Dies reduziert die Bearbeitungszeit erheblich und minimiert das Risiko der Probe Schalter als Wechsel zwischen der Demobilisierung-Arbeitsplatz und den Speichelfluss-Platte ist nicht notwendig. Darüber hinaus erlaubt es die Mücken auf dem erzwungenen Speichelfluss Gerät sofort nach der Demobilisierung platzieren. Diese eher kurze Mücke Bearbeitungszeit ist entscheidend für erfolgreiche erzwungene Speichelfluss. Schließlich können die Mücken direkt auf Motilität in das ganze Experiment überwacht werden.
Die hier vorgestellten Speichelfluss-Assay wird verwendet, um Einblicke in das Vektor-Potenzial der Mückenarten. Jedoch, einige konkreten Fragen zu beantworten (zB., die Zahlen von Mückenstichen, die erforderlich sind, um Wirbeltiere infizieren), tierische Experimente noch erforderlich sein könnten.

In 2015, Zika-Virus (ZIKV), assoziiert ein Moskitos übertragene Virus (Mobovirus) aus der Familie , die Flaviviridae, in Kolumbien und Brasilien entstand und verbreitete sich rasch in ganz Nord-und Südamerika und der Karibik, verursacht eine Epidemie mit einer bemerkenswerten Anzahl von klinische Fälle von Mikrozephalie und Guillain-Barré-Syndrom1. Stechmücken der Gattung Aedes Aegypti und Aedes Albopictus gelten die primären und sekundären Vektoren von ZIKV2, aber andere Arten der Gattung Aedes haben auch bewiesen, experimentelle vektorkompetenz3 haben . Im Gegensatz zu den Aedes -Arten sind die meisten der Gattung Culex getestet bisher nicht in der Lage, das Virus4übertragen. Bloß, lieferten die Daten für Culex Quinquefasciatus eindeutigen Ergebnisse3. Derzeit fehlen Informationen über Moskito vektorkompetenz für ZIKV bei moderaten Temperaturen (< 20 ° C). Diese Information ist jedoch wesentlich für die Risikobewertung von möglichen Spreads in Regionen mit gemäßigtem Klima wie Mitteleuropa.
Ein kompetenter Vektor für ZIKV ist in der Lage zu erwerben, zu erhalten, zu verstärken und schließlich das Virus übertragen. Deshalb testen die Mücke Organe oder Körperteile, wie Beine, Mitteldarm, Kopf oder Speicheldrüsen, für ZIKV nicht ausreichen, um vektorkompetenz bestimmen. Es ist obligatorisch, infektiösen Viruspartikeln in freigegebenen Speichel testen. Zur Beurteilung vektorkompetenz müssen Infektionsrate (IR, Anzahl der ZIKV-positiven Moskito Körper pro Anzahl der engorged Mücken) und Übertragungsrate (TR, Anzahl der Mücken mit ZIKV-positiven Speichel pro Anzahl der ZIKV-positiven Moskito Körper), bestimmt. IRs Mücken kann leicht durch einfach homogenisierende Mücken gefolgt von eine Echtzeit-Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) analysiert werden gezielt ZIKV. Darüber hinaus kann die Infektion weiter charakterisiert werden, durch die Bestimmung der viralen heftnummern pro Mücke. Im Gegensatz dazu setzt die Analyse der Übertragungsraten auf die Erkennung von lebensfähigen Viruspartikel im Speichel der einzelnen Mücken. Dies kann erreicht werden durch die Fütterung von infizierten Mücken auf empfänglichen Wirtstiere, gefolgt von der Analyse der Virämie in der Host-5. Jedoch diese Methode stützt sich auf geeignete Modellorganismen und ist kostspielig und durch Tierschutz Vorschriften beschränkt. Um den Einsatz von Versuchstieren für die Analyse von Übertragungsraten zu vermeiden und Kosten zu senken, beschrieben künstliche neu Zuführsysteme mit Blut Tropfen wurden6. Prüfung auf individuellen Ebene kombiniert mit einer hohen Anzahl von Personen ist jedoch schwierig und zeitaufwändig. Die erste Beschreibung eines Speichelfluss Assays auf individueller Ebene erschien 19667 und erzwungene Speichelfluss Experimente geworden in den letzten Jahren die Methode der Wahl, die vektorkompetenz von Stechmücken3,8 zu bewerten .
Basierend auf unsere Vektor-Kompetenz-Studie der mitteleuropäischen Mücken veröffentlichte vor kurzem9, beschreiben wir gezwungen Speichelfluss, wie Anderson Et al.berichtet. 8 mit einigen Änderungen. Diese Methode ermöglicht hoher Durchsatz standardisiert Experimente Bedingungen hohe Biosafety Niveau (BSL-3) und umfasst die Ermittlung des aktiven Virus durch Zelle Kultur basierte Assays. Die hier beschriebenen Experimente gehören 856 Mücken. Sie waren mit ZIKV durch künstliche Blutmahlzeit angesteckt und anschließend auf das Vorhandensein von infektiösen Viruspartikeln im Speichel analysiert. Die Mücken in die Experimente bestand aus zwei alteingesessenen Labor Populationen von Ae. Aegypti und Culex Pipiens Pipiens Biotyp Molestus (Cx. p. Molestus) sowie Feld eingeführt gefangen Culex Pipiens Pipiens Biotyp Pipiens (Cx. s. Pipiens), Culex Torrentium (Cx. Torrentium) und zwei Ae. Albopictus Populationen. Mit Ausnahme von einem der beiden Ae. Albopictus Populationen, die in Italien gesammelt wurde, wurden alle Mücken in Deutschland gesammelt.

<table><tbody><tr><td>Inject+matic Sleeper</td><td>Inject+matic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bugdorm-1 Insect Rearing Cage</td><td>BugDorm Store</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drosophila cultivation tubes</td><td>carl roth</td><td>PK11.2</td><td>plastic vial for mosquitoes</td></tr><tr><td>Plug for drosophila cultivation tubes</td><td>carl roth</td><td>PK15.1</td><td></td></tr><tr><td>Constant climate chamber</td><td>Binder</td><td>KBF-240</td><td></td></tr><tr><td>Blood</td><td></td><td></td><td>banked human blood, expired, not usable for medical application</td></tr><tr><td>Dumont-Pincette Electronic SS</td><td>Dumont</td><td>B40c</td><td></td></tr><tr><td>Vero cells</td><td>BNITM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flash light aspirator</td><td>Bioquip</td><td>2809</td><td></td></tr><tr><td>double-sided adhesive tape</td><td></td><td></td><td>no specific provider</td></tr><tr><td>Gammex Powder-free gloves with AMT</td><td>Ansell</td><td></td><td>for safety reasons necessary during work with pricks in the BSL3 laboratory</td></tr><tr><td>RealStar Zika Virus RT-PCR-Kit</td><td>altona diagnostics</td><td>591013</td><td></td></tr><tr><td>MagMax Pathogen RNA/DNA Kit</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>4462359</td><td>RNA isolation of mosquito bodies</td></tr><tr><td>Qiamp viral RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>52906</td><td>RNA-Isolation of supernatant</td></tr><tr><td>filter tips (20 &amp;micro;L)</td><td>Sarstedt</td><td>701,116,210</td><td>Cut the first 3 mm of the tip</td></tr><tr><td>hand motor mixer</td><td>carl roth</td><td>sold out</td><td></td></tr><tr><td>micro pestles for hand motor mixer</td><td>carl roth</td><td>CXH8.1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td>P0403550</td><td></td></tr><tr><td>L Glutamine Penicilin/Streptomycin</td><td>PAN</td><td>P0819100</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>PAN</td><td>P06-0110</td><td></td></tr><tr><td>Fructose</td><td>carl roth</td><td>4981.5</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>PAN</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>PAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvat</td><td>PAN</td><td>P0443100</td><td></td></tr><tr><td>MEM NAA</td><td>PAN</td><td>P0832100</td><td></td></tr><tr><td>Hemotek Feeder</td><td>Hemotek</td><td>PS6</td><td></td></tr><tr><td>Light Cycler</td><td>Roche</td><td>480 II</td><td></td></tr><tr><td>Light Cycler Software</td><td>Roche</td><td>480 SW 1.5.1</td><td></td></tr><tr><td>Modeling clay</td><td></td><td></td><td>no specific provider</td></tr><tr><td>King Fisher Flex Purification System</td><td>ThermoFisher scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Aedes albopictus&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>eggs were collected in Freiburg, Germany</td></tr><tr><td>Binocular</td><td>MOTIC</td><td>SMZ-168</td><td></td></tr><tr><td>Binocular light</td><td>MOTIC</td><td>MLC-150C</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-Incubator</td><td>Thermo scientific</td><td>MIDI 40</td><td></td></tr></tbody></table>

forced salivation as a method to analyze vector competence of mosquitoes

Vektorkompetenz ist definiert als das Potenzial einer Mückenarten Moskitos übertragene Virus (Mobovirus) zu einem fest gefügten Host übertragen. Tragfähige Viruspartikel sind während einer Blutmahlzeit über den Speichel einer infizierten Mücke übertragen. Erzwungene Speichelfluss Assays ermöglichen Bestimmung der potentiellen Vektor auf der Grundlage der einzelnen Mücken, den Verzicht auf Tierversuche. Die Methode ist geeignet, eine große Anzahl von Mücken in einem Experiment innerhalb kurzer Zeit zu analysieren. Erzwungene Speichelfluss Assays wurden verwendet, um 856 einzelne Mücken in Deutschland, darunter zwei verschiedene gefangen analysieren Culex Pipiens Pipiens Biotope, Culex Torrentium sowie Aedes Albopictus, die experimentell infiziert wurden mit Zika-Virus (ZIKV) und inkubierten bei 18 ° C und 27 ° C für zwei bis drei Wochen. Die Ergebnisse zeigten die mangelnde vektorkompetenz von verschiedenen Culex Taxa für ZIKV. Im Gegensatz dazu war Aedes Albopictus anfällig für ZIKV, aber nur bei 27 ° C, mit Übertragungsraten, die ähnlich wie eine Aedes Aegypti Labor Kolonie parallel getestet.

Aedes Aegypti ist als kompetenter Vektor für ZIKV zumindest unter tropischen Klimabedingungen12bekannt. Daher verwendet wir Ae. Aegypti als Positivkontrolle der Assay etablieren und IRs sowie TRs bei einer Inkubationstemperatur von 27 ° C und einer Luftfeuchtigkeit von 80 % zu analysieren. IR und TR wurden definiert, wie zuvor beschrieben von Fortuna Et Al. 13. Challenged Ae. Aegypti zeigte IR von 50 % und 72 % und TR von 42 % und 31 % bei 14 und 21 Tagen post Infektion (dpi), bzw. (Abbildung 1A und 1 b). Anschließend wurden europäische Stechmücken für ZIKV Infektion und Übertragung mit tropischen sowie gemäßigten klimatischen Bedingungen getestet.
Bei 27 ° C Inkubationstemperatur zeigten alle Mückenarten ZIKV Infektion an 14 dpi sowie 21 dpi, mit Ausnahme von s. Pipiens Cx. und Cx. Torrentium Einzelpersonen, die mit 14 dpi nur positiv waren. Alle Arten der Aedes zeigte höhere IRs (zwischen 50 % und 72 %) sowie höhere virale RNA-Konzentration (106 bis 109 RNA-Kopien/Moskito-Proben) im Vergleich zu den verschiedenen Taxa Culex , offenbart die IRs zwischen 0 % und 32 % und Viruslast von 103 104 RNA-Kopien/Moskito-Proben. Alle Arten der Aedes angezeigt ZIKV-positiven Speichel (TR 13 – 42 %), während keiner der Speichelproben von Culex Taxa ZIKV (Abbildung 1A und 1 b) enthalten. Interessanterweise Übertragungsraten bei 21 dpi waren ähnlich in Ae. Aegypti und Ae. Albopictus aus Deutschland (30 %), aber deutlich niedriger in Ae. Albopictus aus Italien (13 %).
Inkubation von herausgefordert Mücken bei mäßiger Temperatur von 18 ° C zeigte im Allgemeinen niedriger Virus lädt in der Aedes -Arten (104– 106 RNA Kopien/Mücke) sowie in den verschiedenen Culex Taxa (102 –104 RNA Kopien/Mücke). Jedoch wurde bei 18 ° C Inkubationstemperatur, Übertragung von ZIKV nicht für eines der untersuchten Mückenarten beobachtet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57980/57980fig1.jpg"> Abbildung 1: Übertragungsraten von Mücken experimentell infiziert mit ZIKV. Ergebnisse der Vektor-Kompetenz-Studium mit ZIKV in verschiedenen Mückenarten. Sechs verschiedene Moskito Taxa wurden mit ZIKV infiziert und bei 27 ° C und 18 ° C für 14 (A) oder 21 (B) Tage inkubiert. TR ist definiert als die Anzahl der Mücken mit ZIKV-positiven Speichel pro Anzahl der ZIKV-positiven Moskito Körper. Die Gesamtzahl der Moskitos untersucht wurde 856, mit einem Minimum von 30 Personen für jede Zeit-Punkt/Temperatur/Moskito-Taxa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57980/57980fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

Gezwungen Speichelfluss als Methode zur Vektorkompetenz von Stechmücken Analyse

Für die effiziente Steuerung der Moskito Virusübertragung zu tragen ist die Kenntnis der Vektor Potential der jeweiligen Mücken von besonderem Interesse. Wir beschreiben erzwungene Speichelfluss als Methode zur vektorkompetenz von Aedes Albopictus und drei verschiedenen Culex Taxa für die Übertragung der Zika-Virus zu analysieren.

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...

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Research

JoVE Journal

Biology

9.5K Aufrufe.  Bernhard Nocht Institute for Tropical Medicine. Für die effiziente Steuerung der Moskito Virusübertragung zu tragen ist die Kenntnis der Vektor Potential der jeweiligen Mücken von besonderem Interesse. Wir beschreiben erzwungene Speichelfluss als Methode zur vektorkompetenz von Aedes Albopictus und drei verschiedenen Culex Taxa für die Übertragung der Zika-Virus zu analysieren.

Serie: Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

Alphavirus Transducing System:  Tools for Visualizing Infection in Mosquito Vectors

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection. ATSs are derived from cDNA clones of mosquito-borne RNA viruses (genus Alphavirus; family Togaviridae). The Alphavirus genus contains about 30 different mosquito-borne virus species. Alphaviruses are enveloped viruses and contain single-stranded RNA genomes (~11.7 Kb). Alphaviruses transcribe a subgenomic mRNA that encodes the structural proteins of the virus required for encapsidation of the genome and maturation of the virus. Alphaviruses are usually highly lytic in vertebrate cells, but persistently infect susceptible mosquito cells with minimal cytopathology. These attributes make them excellent tools for gene expression in mosquito vectors. The most common ATSs in use are derived from Sindbis virus (SINV). The broad species tropism of SINV allows for infection of insect, avian, and mammalian cells8. However, ATSs have been derived from other alphaviruses as well9,10,20. Foreign gene expression is made possible by the insertion of an additional viral subgenomic RNA initiation site or promoter. ATSs in which an exogenous gene sequence is positioned 5' to the viral structural genes is used for stable protein expression in insects. ATSs, in which a gene sequence is positioned 3' to the structural genes, is used to trigger RNAi and silence expression of that gene in the insect.
ATSs have proven to be valuable tools for understanding vector-pathogen interactions, molecular details of viral replication and maintenance infectious cycles3,4,11,19,21. In particular, the expression of fluorescent and bioluminescent reporters has been instrumental tracking the viral infection in the vector and virus transmission5,14-16,18. Additionally, the vector immune response has been described using two strains of SINV engineered to express GFP2,9.
Here, we present a method for the production of SINV containing a fluorescent reporter (GFP) from the cDNA infectious clone. Infectious, full-length RNA is transcribed from the linearized cDNA clone. Infectious RNA is introduced into permissive target cells by electroporation. Transfected cells generate infectious virus particles expressing the GOI. Harvested virus is used to infect mosquitoes, as described here, or other host species (not shown herein). Vector competence is assessed by detecting fluorescence outside the midgut or by monitoring virus transmission7. Use of a fluorescent reporter as the GOI allows for convenient estimation of virus spread throughout a cell culture, for determination of rate of infection, dissemination in exposed mosquitoes, virus transmission from the mosquito and provides a rapid gauge of vector competence.

Methods for using alphavirus transducing systems to express fluorescent reporters in vitro and in adult mosquitoes are described. This technique may be adapted to express any protein of interest in lieu of or in addition to a reporter.

Alphavirus transduzierenden System: Werkzeuge für die Visualisierung Infektion in Mosquito Vektoren

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection.  ATSs are derived from cDNA clones of ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Reproducible dsRNA Microinjection and Oviposition Bioassay in Mosquitoes and House Flies

Synthetic dsRNAs, used to induce RNA interference, may have dose dependent phenotypic effects. These effects are difficult to define if the dsRNAs are delivered using a non-quantitative method. Accurate delivery of known quantities of nucleic acids or other chemicals is critical to measure the efficacy of the compound being tested and to allow reliable comparison between compounds.
Here we provide a reproducible, quantitative microinjection protocol that ensures accurate delivery of specific doses of dsRNA, reducing the mortality typically induced by injection injury. These modifications include the addition of Rhodamine B, a graduated injection needle, and an improved recovery method borrowed from Isoe and Collins. This method allows calculation of dose responses and facilitates comparisons between compounds. Versions of this method have been successfully used on three genera of mosquitoes as well as house flies to assess the reduction in fecundity resulting from gene silencing of ribosomal RNA transcripts.
This protocol provides strategies to reduce several challenges of small insect microinjection. Together, mechanical delivery of dsRNAs accompanied by visual verification, identification of effective locations for delivery, and inclusion of a post-injection recovery period ensure accurate dosing and low injury mortality. This protocol also describes an oviposition bioassay for uniform determination of effects on fecundity.

This protocol describes a microinjection methodology that we have standardized and used for several years to deliver specific quantities of nucleic acids directly to the hemolymph of mosquitoes and house flies. This protocol results in minimal injection mortality and allows dose correlated measurements of fecundity.

Reproduzierbare DsRNA Mikroinjektion und Eiablage Bioassay in Mücken und Stubenfliegen

Synthetic dsRNAs, used to induce RNA interference, may have dose dependent phenotypic effects. These effects are difficult to define if the dsRNAs are ...

Umwelt

Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae

In vivo microinjection is the most commonly used gene transfer technique for analyzing the gene functions in individual mosquitoes. However, this method requires a more technically demanding operation and involves complicated procedures, especially when used in larvae due to their small size, relatively thin and fragile cuticle, and high mortality, which limit its application. In contrast, viral vectors for gene delivery have been developed to surmount extracellular and intracellular barriers. These systems have the advantages of easy manipulation, high gene transduction efficiency, long-term maintenance of gene expression, and the ability to produce persistent effects in vivo. Mosquito densoviruses (MDVs) are mosquito-specific, small single-stranded DNA viruses that can effectively deliver foreign nucleic acids into mosquito cells; however, the replacement or insertion of foreign genes to create recombinant viruses typically causes a loss of packaging and/or replication abilities, which is a barrier to the development of these viruses as delivery vectors.
Herein, we report using an artificial intronic small-RNA expression strategy to develop a non-defective recombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo delivery system. Detailed procedures for the construction, packaging and quantitative analysis of the rAaeDV vectors, and for larval infection are described.
This study demonstrates, for the first time, the feasibility of developing a non-defective recombinant MDV micro RNA (miRNA) expression system, and thus providing a powerful tool for the functional analysis of genes in mosquito and establishing a basis for the application of viral paratransgenesis for controlling mosquito-borne diseases. We demonstrated that Aedes albopictus 1st instar larvae could be easily and effectively infected by introducing the virus into the water body of the larvae breeding site and that the developed rAaeDVs could be used to overexpress or knock down the expression of a specific target gene in larvae, providing a tool for the functional analysis of mosquito genes.

We report using an artificial intronic small RNA expression strategy to develop a non-defective recombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo delivery system. A detailed procedure for the construction, packaging, and quantitative analysis of the rAaeDV vectors as well as for larval infection is described.

Verwendung von einem rekombinanten Moskito Densovirus als gen Lieferung Vektor für die funktionelle Analyse von Genen in Mückenlarven

In vivo microinjection is the most commonly used gene transfer technique for analyzing the gene functions in individual mosquitoes. However, this method ...

Entwicklungsbiologie

Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response

The stimulation of immune responses is a common tool in invertebrate studies to examine the efficacy and the mechanisms of immunity. This stimulation is based on the injection of non-pathogenic particles into insects, as the particles will be detected by the immune system and will induce the production of immune effectors. We focus here on the stimulation of the melanization response in the mosquito Anopheles gambiae. The melanization response results in the encapsulation of foreign particles and parasites with a dark layer of melanin. To stimulate this response, mosquitoes are inoculated with beads in the thoracic cavity using microcapillary glass tubes. Then, after 24 hr, the mosquitoes are dissected to retrieve the beads. The degree of melanization of the bead is measured using image analysis software. Beads do not have the pathogenic effects of parasites, or their capacity to evade or suppress the immune response. These injections are a way to measure immune efficacy and the impact of immune stimulations on other life history traits, such as fecundity or longevity. It is not exactly the same as directly studying host-parasite interactions, but it is an interesting tool to study immunity and its evolutionary ecology.

Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response

Through inoculation with beads, the described technique enables the stimulation of the mosquito melanization response in the hemolymph circulating system. The amount of melanin covering the beads can be measured after dissection as a measure of the immune response.

Impfen<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Mosquitoes mit Perlen der Melanisierung Immunantwort zu induzieren und Messen

The stimulation of immune responses is a common tool in invertebrate studies to examine the efficacy and the mechanisms of immunity. This stimulation is ...

Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. However, effective malaria parasite targets for vaccine and chemotherapy development are still limited. This is largely due to the unavailability of relevant and practical in vivo infection models for human Plasmodium species, most notably for P.&#160;falciparum and P. vivax. Therefore, rodent malaria species have been extensively used as practical alternative in vivo models for malaria vaccine, drug targeting, immune response, and functional characterization studies of conserved Plasmodiumspp. genes. Indeed, rodent malaria models have proven to be invaluable, especially for exploring mosquito transmission and liver stage biology, and were indispensable for immunological studies. However, there are discrepancies in the methods used to evaluate the phenotypes of transgenic and wild-type asexual and sexual blood-stage parasites.&#160;Examples of these discrepancies are the choice of an intravenous vs. intraperitoneal infection of rodents with blood-stage parasites and the evaluation of male gamete exflagellation. Herein, we detail standardized experimental methods to evaluate the phenotypes of asexual and sexual blood stages in transgenic parasites expressing reporter-gene or wild-type rodent malaria parasite species. We also detail the methods to evaluate the phenotypes of malaria parasite mosquito stages (gametes, ookinetes, oocysts, and sporozoites) inside Anopheles mosquito vectors. These methods are detailed and simplified here for the lethal and non-lethal strains of P. berghei and P. yoelii but can also be applied with some adjustments to P. chabaudi and P. vinckei rodent malaria species.

Due to the striking similarities of the life cycle and biology of rodent malaria parasites to human malaria parasites, rodent malaria models have become indispensable for malaria research. Herein, we standardized some of the most important techniques used in the phenotypic analysis of wild-type and transgenic rodent malaria species.

Phänotypische Analyse von Nagetier Malaria Parasiten Asexual und Sexuelle Blutstadien und Mückenstadien

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

Vektorkompetenzanalysen an Aedes aegypti Mücken mit Zika-Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public health. Once ingested, the viruses must overcome the mosquito midgut barrier to reach the hemolymph, from where they might potentially spread to the salivary glands. When a mosquito bites, these viruses are spread to new vertebrate hosts. Similarly, the mosquito may pick up different viruses. In general, only a tiny portion of viruses may enter the salivary glands via the gut. The transmission efficiency of these viruses to the glands is be affected by the two physical barriers found in different mosquito species: midgut barriers and salivary glands barriers. This protocol presents a method for virus detection in salivary glands of Aedes aegypti&#39;s&#160;following oral feeding and intrathoracic injection infection. Furthermore, determining whether the guts and/or salivary glands hinder viral spread can aid in the risk assessments of MBVs transmitted by Aedes aegypti.

This methodology, which included oral feeding and intrathoracic injection infection, could effectively assess the influence of midgut and/or salivary gland barriers on arbovirus infection.

Experimentelle Virusinfektion bei adulten Stechmücken durch orale Fütterung und Mikroinjektion

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...

Effective Oral RNA Interference (RNAi) Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) administration has been accomplished primarily via injection, which requires significant time and is not suitable for field applications. To overcome these limitations, here we present a more efficient method for robust activation of RNAi by oral delivery of dsRNA to adult Anopheles gambiae. Long dsRNAs were produced in Escherichia coli strain HT115 (DE3), and a concentrated suspension of heat-killed dsRNA-containing bacteria in 10% sucrose was offered on cotton balls ad-libitum to adult mosquitoes. Cotton balls were replaced every 2 days for the duration of the treatment. Use of this method to target doublesex (a gene involved in sex differentiation) or fork head (which encodes a salivary gland transcription factor) resulted in reduced target gene expression and/or protein immunofluorescence signal, as measured by quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) or fluorescence confocal microscopy, respectively. Defects in salivary gland morphology were also observed. This highly flexible, user-friendly, low-cost, time-efficient method of dsRNA delivery could be broadly applicable to target genes important for insect vector physiology and beyond.

Effective Oral RNA Interference RNAi Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

The oral administration of dsRNA produced by bacteria, a delivery method for RNA interference (RNAi) that is routinely used in Caenorhabditis elegans, was successfully applied here to adult mosquitoes. Our method allows for robust reverse genetics studies and transmission-blocking vector studies without the use of injection.

Effektive orale RNA-Interferenz (RNAi) Verabreichung an erwachsene Anopheles gambiae-Mücken

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) ...

Biologie

Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. Insecticide resistance surveillance of mosquito populations is typically done through Centers for Disease Control and Prevention (CDC) bottle bioassays or World Health Organization (WHO) tube tests. However, these methods can result in a high degree of variability in mortality data due to variable insecticide contact with&#160;the insect, the relatively small numbers of organisms tested, extensive variation in mass between populations, and constantly changing environmental conditions, leading to variable outcomes. This paper presents the topical application bioassay, adapted as a high-throughput phenotypic bioassay for both mosquitoes and fruit flies, to test large numbers of insects along&#160;a range of insecticide concentrations.
This assay 1) ensures consistent treatment and insecticide contact with every organism, 2) produces highly specific dose-response curves that account for differences in average mass between strains and sexes (which is particularly important for field-collected organisms), and 3) allows for the calculation of statistically rigorous median lethal doses (LD50), which are necessary for resistance ratio comparisons-an alternative surveillance approach from diagnostic dose mortality, which is also used for larvicide resistance surveillance. This assay will be a complementary tool for accurately phenotyping mosquito populations and, as illustrated using fruit flies, is easily adaptable for use with other insects. We argue that this assay will help fill the gap between genotypic and phenotypic insecticide resistance in multiple insect species.

We describe the methodology and importance of the topical application bioassay to measure insecticide susceptibility in mosquitoes and fruit flies. The presented assay is high-throughput, utilizes insect mass-thus allowing for calculating a mass-relativized lethal dose instead of concentration-and likely has lower variability than other similar methods.

Topische Anwendung Bioassay zur Quantifizierung der Insektizidtoxizität für Moskitos und Fruchtfliegen

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. ...

Topical Testing Assay: A Technique to Evaluate the Insecticidal Potential of Dopamine Receptor Antagonists on Adult Female Mosquitoes by Topical Application

Culture 3 to 5-day-old adult female mosquitoes in a 20-liter plastic cage. Label 9-ounce paper cups with the name and concentration of testing compound.
Next, prepare a 10 &#181;g/&#181;L stock solution of the testing compound in acetone in a 20-milliliter glass vial. Then, serially dilute the stock solution to obtain the desired working concentrations.
Clean a 1-milliliter glass syringe with acetone, and then, fill it with the test solution at the appropriate concentration. Secure the syringe in a micro-applicator, adjusted to deliver a volume of 0.25 microliters.
Next, use an aspirator to remove ten 3 to 5-day-old adult female mosquitoes from the cage, and anesthetize them for 5 minutes at 4 degrees Celsius. Then, transfer the mosquitoes to a Petri dish, and place the dish on ice for 10 minutes.
In order to avoid damaging the adult mosquito, which could contribute to mortality, ensure that they are not anesthetized in the fridge for more than 5 minutes, or immobilized on ice for more than 10, and minimize the handling of the mosquitoes. If you have access to a cold plate and a micromanipulator with a movable stage, that may further minimize handling of the mosquitoes.
Use fine tweezers to remove each mosquito from the dish. With the syringe micro-applicator, apply 0.25 microliters of testing solution to the dorsal thorax under a dissecting microscope. Next, transfer the mosquitoes to a labeled paper cup on ice. Seal the cup with a 10 by 10-centimeter mesh square, and a rubber band. Then, transfer it to the growth chamber, and record the number of dead mosquitoes.

Topischer Test-Assay: Eine Technik zur Bewertung des insektiziden Potenzials von Dopaminrezeptor-Antagonisten bei erwachsenen weiblichen Mücken durch topische Anwendung