マックス ・ プランク協会の近年の設定と同様、この研究を科学の人間の歴史の安定同位体部考古学、マックス ・ プランク研究所の資金のために感謝したいと思います。

次のプロトコル人間史科学のマックス ・ プランク研究所光同位体比質量分析法研究所のガイドラインに従います。絶滅危惧種の近代的なまたは歴史的の群集標本を含む解析および現代的なステーク ホルダーへ関心のある考古学と動物素材の使用、適切な倫理国家と国際委員会から権限を求める必要があります。.本稿で使用されるサンプルは考古学および化石の標本だった。生きている人間は、本研究のために使用されなかったし、破壊的な分析の完全倫理的、機関、および政府の権限が与えられます。
1. バルク サンプリング
注: 人間と動物は、一括法の基本的な歯のエナメル質のサンプリングは、ドリルの歯の頬側の端への応用。
<ol><li>ドリルのセットアップを使用して穏やかな摩耗、ブラスターを撃ったアルミニウムを用いた歯 (~0.1 mm) の外面をきれい。きれいなダイヤモンドひっくり返されたドリル ビットも形状、ドリル セットアップにチャックを介して接続されている (下記参照)、手持ち型のドリルを使用します。優しくても摩耗が全体の成長軸に平行溝として実行されることを確保する (図 1と図 2)。</li>
	<li>試み、可能であれば、それぞれの人間の同じ歯部分またはサンプリング動物にメソッドを適用します。 注: 人間 paleodietary 研究では、第三大臼歯一般的に愛されている代表的な後半の少年/大人の食事効果23を離乳のため第一大臼歯を回避しながら。使用可能なサンプルと質問調査の下で最寄りの歯にはそれぞれの分類群と表される、人生の期間が異なります。</li>
	<li>歯のエナメル質の粉末の吸入を避けるためにマスクを着用しながら部屋を換気ドリルします。目を保護するゴーグルを着用します。掘削試料粉末量分析、前処理プロトコル、および歯のサイズに使用する装置によって異なることに注意します。サンプルの加熱を防ぐために低速でドリルします。 注: サンプル粉末 4 ~ 8 mg とほぼ、同位体比質量分析法および続成作用によるテストのオンライン ガスの準備と導入システムを使用して複数の解析のための適切な目標です。選ばれたドリル速度がサンプルのもろさによって異なり、試行錯誤のいくつかのレベルが必要になります注意してください。一般に、手持ち型のドリルの強度の 2 のうち 5 バーで十分です。きれいなアルミ箔の部分に歯磨き粉をドリルまたは紙の重量を量るします。</li>
	<li>その結果エナメル質粉末を収集を掘削する前に適切に正確なバランス tared された 1.5 mL マイクロ遠心チューブに転送しています。サンプルの指定 (図 3) の各チューブにラベルを付けます。電子データベースと同様に、実験ノートにサンプル番号とエナメル質重量を記録します。</li>
	<li>それぞれの新しい歯を掘削する前にまず 0.5 M 塩酸を使用して堅牢な組織に活用ドリル ビットをクリーンアップします。有機溶剤 (アセトン、メタノール、エタノールなど) にドリルビットを洗い流し堅牢な組織を使用します。</li>
	<li>専用使用して徹底的にワークスペースのクリーン掘削に座って、次の掃除機やちりとりとブラシ。メタノールを用いたサンプリング領域を拭いてください。真空やサンプル間のほこりやサンプルの粉末を削除する圧縮空気でドリルを軽くスプレーします。</li>
</ol>2. 連続サンプリング
注: シーケンシャル サンプリングはさまざまな形で近づくことができる、サンプリングされる分類群、必要な時間分解能と同様に、歯のサイズによって異なります。
<ol><li>非常に薄いを外してサンプリングされている歯の表面をきれいに外側の歯のエナメル質の層を (~0.1 mm)。</li>
	<li>王冠の上にエナメルのルートのジャンクションから実行している、歯の成長軸に垂直な頬の表面に沿ったサンプルをドリルします。エナメルの層間で 1-2 mm 広い溝の結果各サンプルに成長軸に垂直水平方向のバンドをドリル (図 1と図 4)。それは、サンプルとその結果の測定を汚染するだろうと象牙質にエナメルのドリルスルーを避けるために注意してください。 注: サンプルの数は、必要な解像度によって異なりますが、c. 10 δ13C と hypsodont の家畜牛のサイズの δ18O 値の季節変化の研究に適切な目標を表します。</li>
	<li>サンプリング ラインの幅はドリル刃の直径によって決定されます、各サンプルの適切なドリル ビットを選択します。</li>
	<li>リグのセットアップを使用して、増分のサンプル (図 2) の大きい数を必要とするより敏感な歯のため (e.g。、ヒトの歯), だけでなく、より安定した加工。下向きドリル刃で安全に、ドリルを保持しているリグ スタンドを設定します。 注: 4 つのサンプルは、ハンドヘルド アプローチ24を使用して永久的な人間の大臼歯から簡単に得ることより洗練されたサンプリング リグが必要ですまたは CO2レーザー アブレーション アプローチはないことはここで説明した14。もう一つの一般的なアプローチは、半自動化された特定25を使用することです。</li>
	<li>歯を押したり、クランプに取り付けます。ドリル ビットに対して歯のエナメル質を押し圧力を適用します。サンプルが掘削段階的頬の表面に沿って頂点 (咬合面) からエナメル ルート ジャンクション (ERJ) の位置に王冠のベースに。複数回掘削前のサンプル ラインに平行な各連続線戦略を掘削同じサンプルをレプリケートします。羊の臼歯, 直径 1 mm (図 1) などの繊細な歯に小さな円筒形ダイヤモンド ドリル ビットを使用します。</li>
	<li>キャリパーを使用して ERJ からそれぞれサンプリング ラインの距離を測定し、比較のためこの距離を記録します。</li>
	<li>手順 1.3-1.6 上記に従ってください。 注: 小さく、敏感な歯を分析されている前処理・続成のチェック方法が適用されない場合、1-4 mg のような小さなサンプルは炭酸分析オンライン ガスの準備と導入セットアップに信頼性の高い結果を生成します。変更された自動化周辺機器システムは、さらに低い重みのサンプルの使用を容易にすることができますが、研究エナメル (4 ~ 5 wt %)26,27炭酸の割合は必然的に限られました。研究者は、研究室のサンプルが必要な試料の量を決定する測定するつもりですと相談してください。</li>
</ol>3. フーリエ変換赤外分光法/弱毒総反射法
<ol><li>減衰全反射率法のサンプル室背景、真空下でまたは通常の大気条件を確立します。</li>
	<li>歯のエナメル質の約 1 mg をへらを使用して試料室のダイヤモンド結晶にかぶせます。下げる、記事、サンプル、およびダイヤモンド プレートの間事務所の接続があるまで、サンプルの投稿を固定します。または確立されている真空なし、セットアップ、または可用性に応じて、試料室を閉じます。</li>
	<li>64 倍の 400 と 4,000 cm-1まで波数サンプルの赤外スペクトルを測定します。複製の目的の数は、取り込んで住宅サンプル遠心チューブに返されます別の因数と理想的には、3 つの複製の解析は、堅牢な結果にもかかわらず、研究の目標に応じて異なります。</li>
	<li>メタノールそれぞれ因数と各サンプル間にヘラをクリーンアップします。</li>
	<li>利用可能なソフトウェアを使用してベースライン補正を実行します。ソフトウェアは自動的に結果の FTIR プロファイルからサンプル室のバック グラウンドを減算します。再現性が向上するように、のみエナメル 0.06 ~1035 cm-1に最高のリン酸バンドのための最低限の吸光度スペクトル必要があります考慮します。</li>
	<li>711 cm-1にピークをチェックしてすべてのサンプルに共通の二次汚染物質炭酸塩方解石の存在を監視します。</li>
	<li>分析の結果、慎重にヘラや吸引装置を使用して、遠心チューブにサンプルを返す、前処理や分析の次の段階の上に取る。</li>
	<li>.Csv ファイルとして (または類似の) 波長と強度の生データをエクスポートし、金利の指標を計算する (一般的に使用される指標は、A サイト リン酸インデックス、B サイト インデックスはリン酸、リン酸塩結晶度、水-アミド リン酸指数とCO3/PO4インデックスの17,18,19) (表 1)。</li>
	<li>比較結果化石または考古学的なサンプルから、FTIR で今成長している近代的な動物の歯のエナメル質のデータセット文学19,20で利用できる性質とする変質の程度を決定するため、エナメル質サンプリングします。</li>
</ol>4. 簡単な酢酸 (0.1 M) 前処理
<ol><li>適切なバランスを使用して微量遠心チューブに各サンプルのエナメル質粉末重量を量る。チューブをそれに応じてラベルします。エナメル質粉末は同じ程度、同じようなサイズの粒子と地面をある必要があります。 注: 多くの研究者は、希釈の漂白剤 (NaClO) などの酸化剤を利用または 30% 過酸化水素 (H2O2) サンプルとこれから有機物を削除する必要がありますこの時点で追加されます。ただし、可能性がありますこれらの試薬は安定炭素と試料の酸素同位体比を変更だけでなくオンライン ガス準備・導入システムの骨コラーゲン サンプル スペクトルを示す 100% リン酸が炭酸で利用すること測定は有機サンプル (図 5)、この手順は必要であることを示唆するいると反応しません。</li>
	<li>(エナメル質の 1 mg) あたり 0.1 M 酢酸 0.1 mL をピペットを使用して各サンプルに追加します。ピペットでサンプルを触れないでください。サンプルやピペット接触に入って来る、交差汚染を避けるために次のサンプルの新しいピペットを使用します。</li>
	<li>扇動、揺れまたは電子アジテーター (図 3) を使用し、座る時間の長時間にわたって 10 分エナメル質粉体が酢酸のままにしないでくださいためにサンプルのまま (> 4 h)。</li>
	<li>13,700 x g で 2 分間遠心機にサンプルを配置します。 注: 低コストの代替は 3,500 x の g があり、少ないサンプルを保持しているが、大規模なサンプル セットを扱うときより時間がかかるがこれで 4 分のミニ遠心分離機の使用です。</li>
	<li>遠心プログラムが停止したとき、13,700 x g で 2 分間きれいなピペット、遠心、サンプルを使用して超純水 2 mL に酢酸を置き換えます。</li>
	<li>超純水水を変更する前に、さらに 2 回、中立性をテストします。(上清を妨げないで) ピペットを使用して残りの液を削除します。 注: 超純水洗浄を 3 つの合計は、中立性を取得する標準的な手順です。中立性に到達するまで、サンプルを洗浄する必要があります。</li>
	<li>パラフィルム (1 cm × 1 cm) のシートをカットし、それぞれ微量遠心チューブにかぶせます。鋭いオブジェクトを使用してサンプルを適切に乾燥センターで小さな穴を作る。</li>
	<li>任意の残りの液を削除する乾燥凍結にチューブを配置します。 注: 凍結乾燥ではない利用できる、穏やかなオーブン乾燥 (40 ° C) がされている可能性もと安定炭素・酸素同位体比データへの悪影響はありません。</li>
	<li>一度乾燥、パラフィルムを削除し、遠心の蓋を閉じます。チューブ ラベルが正しいことを確認し、必要に応じて再書き込み。 注: これは保存する前にうちの分析サンプルの配布の前に最終的な段階であるかもしれない限られた資金とラボでの重量を量るための最終段階です。</li>
</ol>5. 計量と測定試料と基準
<ol><li>ヘラを使用すると、tin ディスク 0.001 mg (図 6) に敏感なバランスの上にエナメル質粉末の約 2 mg を量り。リン酸-抵抗力があるホウケイ酸塩ガラス小瓶にサンプルを慎重に転送します。このエナメル質の量は、歯のエナメル質に炭酸の比較的小さい割合のための信頼性の高い結果が得られるに必要です。</li>
	<li>きれいにメタノールを使用してサンプルのヘラや新鮮できれいなディスクを使用して、各サンプル用容器の重量を量るします。</li>
	<li>メルク カコ IAEA CO8 や IAEA 603 IAEA NBS183などの国際標準規格の 0.2 mg を重量を量る。大きな歯の均質化エナメル質から作られた社内標準は、よく20として使用できます。15 基準使用 61 サンプルと標準 76 サンプルの完全な実行のためする必要があります均等に分散される全体にわたって実行します。いくつかの研究は、適切な数の基準や考古学研究20,28の内容を報告しています。 注: 繰り返しの前処理と考古学的なサンプルの実行の数を全体の家標準でエナメル質の分析は調査されるサンプルの精度の適切な測定を提供する可能性がまた20。</li>
	<li>特別に設計された蓋は、中隔はタイトではなくバイアルに吸い込ままで針にアクセスを締めます。きつく締めすぎない蓋中隔への圧力も強くなるし、分析中に最終的に壊れた針で結果することができます。70 ° C に加熱ブロック内で記載されている順序でバイアルを配置します。注文とサンプルの重みは、コンピューター ソフトウェアに入るのためは確実に記録する必要があります。</li>
	<li>次の 3 つの手順でサンプルを測定: 1) フラッシュ純粋ヘリウム詰めてサンプル 2) リン酸の追加、3) サンプルを測定します。<ol>
<li>純粋なヘリウム (等級 5.0) 周囲の空気を洗い流すに 5 分間、100 mL/min の流量でサンプルをフラッシュします。</li>
		<li>リン酸の 4-5 滴を追加 (99%、密度 1.85 g/mL) 炭酸含有サンプルに。サンプルと H3PO4反応を開始します。反応中に CO2がリリースは炭酸塩イオン CO32 -サンプルの同位体値を運ぶ。</li>
		<li>CO2の平衡に到達するまでは、サンプルあたり 1 h を待ちます。1 時間後、信頼性の高い結果を得るためサンプルを測定ください。買収、試料ガスとデバイスへの彼のパスの混合物。乾燥段階では、サンプルのガスの混合物から水を削除します。</li>
		<li>サンプルを測定するには、既知の同位体組成と CO2基準ガスの 3 つのピークから始まります。ピーク強度は、(の間に 4000 に 8000 mV) サンプルのピークの強度に合わせて 4000 mV をする必要があります。3 つの参照ガスのピークは、20 秒長くて 30 秒離れてをする必要があります。サンプルの測定間隔の定義に従ってください。10 倍の 5 検体測定各 s、55 s を離れて。サンプル/ヘリウム混合物 (図 5) の適切なトランスポートを示す時間をかけてピーク高さを減少させることを確認します。 注: 測定中にソフトウェアを計算しますサンプルの同位体組成既知の同位体値、ピークの高さやピーク高さを持つ参照ガスのピークのエリア、サンプルのピークの面積を比較することによって。生の13C/12C と18O/16O のサンプルの構成を計算します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>測定後、試料を正規化します。 注: これは参照ガス質量分析計に導入する際の試料ガスと同じ化学的、物理的パスが行われないため重要です。そのため、サンプルがさらに20サンプル自体としてで実行中の同じの物理的および化学的治療を受ける国際規格 (ステップ 5.3) に調整されていることが不可欠です。これらの国際炭酸標準は、国際デルタ計測スケールにサンプルの 2 点校正と精度と再現性特定の実行中の評価を有効にします。</li>
</ol>

<ol>
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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correspondence+between+stable+carbon,+oxygen+and+nitrogen+isotopes+in+human+tooth+enamel+and+dentine:+infant+diets+at+Kaminaljuyu.">Correspondence between stable carbon, oxygen and nitrogen isotopes in human tooth enamel and dentine: infant diets at Kaminaljuyu.</a> Journal of Archaeological Science. 26 (9), 1159-1170 (1999).</li><li>Schoeninger, M. J., Hallin, K., Reeser, H., Valley, J. W., Fournelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotopic+alteration+of+mammalian+tooth+enamel.">Isotopic alteration of mammalian tooth enamel.</a> International Journal of Osteoarchaeology. 13 (1-2), 11-19 (2003).</li></ol>

著者は利益相反を宣言しません。

サンプリング (一括と差分) 成功の課題歯の知識へのアクセスに依存している掘削技術、試料調製、比較的安価な設備投資と並んで。これらの課題は、簡単に克服できる手順については、サンプリング、前処理の方法に関する明確なとき。この資料でこれらのメソッドの新しい研究者の明確で簡潔な方法でこれらを播種を持っていきたいです。学者が最初にこれらのメソッドを適用する必要が...

歯エナメル質炭酸の安定炭素・酸素同位体比分析は、過去の人間の摂取、離乳しモビリティと同様、群集植生、動物、畜産飼料的運動依存研究に使用されています。これらのアプリケーションを包括的に議論されているし、さまざまなローカル乾燥、温度、水の源、植生の組成1,2,の影響を示す環境条件の見直し3,4,5,6。考古学と古生物学への応用可能性の多様性だけでなく、歯のエナメル質の炭酸塩のよい保存しました安定同位体作業3の魅力的な素材。数出版物1,7つ前までのサンプリング、前処理、および続成作用スクリーニングの方法について説明します。しかし、徹底的な言語および視覚的デモまま大きく使用できない、特に考古学的な科学実験室の外、この技術の利用に関心が高まっている限られた資金と研究所群の人々 に5。
歯のエナメル質は主に成っているハイドロキシアパ タイト (bioapatite) 結晶8骨、それに事後続イオン置換し汚染3抵抗力があるより大きい。現代の研究は、動物の歯の安定炭素同位体 (δ13C) 測定が確実にレコード動物食行動9,10をエナメル質を実証しています。歯のエナメル質の酸素同位体 (δ18O) 値は、水は、水の様々 な環境への影響と同様、植物、動物性食品、飲料水、呼吸、摂取された水の酸素同位体組成によって決まりますさらに同位体分別につながることができます (例えば.、乾燥、温度、高度、降雨量、大陸場所)11。なりました食事や環境の再構成のための普及した方法、古生態学的、考古学、古生物学的研究。
歯エナメル質の形成期 (年) の比較的短いが、サンプリングする歯によって異なります。人間は、第一大臼歯エナメル mineralizes 生年月日と 3 歳の間、小臼歯が 1.5 から 7 歳の間石化、第二大臼歯が 2.5 と 8 歳の間石化、第三大臼歯は 7 のそして 16 年12 間、思春期に石化.与えて歯エナメル質形成する段階的形成期、それ全体の成長軸一括でサンプリングしたり13 形成期間中に発生した食事や環境の変化を調査するために順番にサンプリング.与えられた歯内の食餌療法の変更を日時順に配列、人間と他の動物1,14, 季節と食の年次変動に関する情報を提供する観測可能なオブジェクト。
エナメル質は通常続成作用に耐性が、埋葬の環境から生じる同位体の変更が可能であり15,16, 実験的チェックと前処理の選択肢を有用なものが観察されています。フーリエ変換赤外分光 (FTIR)、伝送モードの減衰で特にが迅速、安価と歯のエナメル質のタフォノミーの変化を評価するため比較的入手しやすい方法として浮上している唯一の方法ですが、特に古生物学的コンテキスト17,18,19、で20。ただし、詳細なプロトコルおよび記録の規格は比較的地球化学や材料科学の分野の外の多くの人々 にアクセスできませんにあります。
反応時間と歯のエナメル質の前処理の研究者によって採用されている化学物質を異なるも、かなりこの変動が安定した炭素と酸素同位体比分析サンプル21 に何か限られた考慮した多くの文献で ,22。ここでは、エナメル質粉末試料の前処理のアプローチ使用希釈酢酸 (0.1 M) であることを報告します。ただし、前処理による同位体比測定の違いは歯のエナメル質の比較的マイナーなため、それを11にデータを比較するデータセットのプロトコルに従う研究者に最適です。さらに、特に完新世のサンプルに、小さな連続したサンプルを採取、前処理選択されるかもしれないない (以下のパイロット続検査) サンプルの無駄を避けるために。
ここでメソッドは、我々 の知識に新しいものではない、これは一括とシーケンシャル サンプリング、前処理の選択、および歯の (FTIR のフォーム) の続成作用によるチェック手法の詳細な記述と視覚的ドキュメント エナメル初めて様々 な学術の聴衆広く利用されました。適用し、このテクニックを公開する者が報告基準、続成作用の考慮事項は、最低限の注意必要があります一方、我々 は我々 の努力このアプローチより簡単にアクセスできるように個人や研究室の広い数を願って、期間5の時間と、分析、分類、研究地域に固有する潜在的な解釈の複雑さと同様、20プレゼンテーションの要件を他の場所で概観した.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dremel Micro</td>
			<td>Dremel</td>
			<td></td>
			<td>https://www.dremel.com/en_US/products/-/show-product/tools/8050-micro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond-tipped drill bit</td>
			<td>Dremel</td>
			<td></td>
			<td>https://www.dremel.com/en_US/products/-/show-product/accessories/7122-diamond-wheel-point</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL micro-centrifuge tube</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t2422?lang=de&#38;region=DE&#38;gclid=EAIaIQobChMI7pHRpauW2QIV77ftCh1p1wjhEAAYASAAEgKzkvD_BwE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Linear Formula:&#160;CH3OH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Linear Formula:&#160;CH3CO2H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dremel rig set-up (workstation)</td>
			<td>Dremel</td>
			<td></td>
			<td>https://www.dremel.com/en_US/products/-/show-product/tools/220-01-workstation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/75002401</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-centrifuge</td>
			<td>Sprout</td>
			<td></td>
			<td>http://www.heathrowscientific.com/sprout-mini-centrifuge-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze drier</td>
			<td>Zirbus Technology</td>
			<td></td>
			<td>http://www.zirbus.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sampling and pretreatment of tooth enamel carbonate for stable carbon and oxygen isotope analysis

人間と動物の歯のエナメル質炭酸の安定炭素・酸素同位体分析は、1000 万年以上前に戻って、最近歴史の期間から paleodietary、古生態学的、および古環境研究の適用されています。一括アプローチは、エナメル質の石灰化の期間の代表的なサンプルを提供し、歯内の連続したサンプルは、この期間中に食事や環境の変化を追跡できます。必要な実験装置の選択を支援するため、徹底的に詳細な実験室のサンプルを記述する明確なガイドラインがなかったこれらの方法論が広く適用し、考古学、生態学、古生物学で説明されているとプロトコル。この記事で文書化原文と、視覚的に実験室の設定の様々 な応用を考える研究者に方法論をより広く利用できるように前処理や続成作用スクリーニングを通してサンプリングから全体のプロセス。

上記の手順を使用して、増分エナメル bioapatite サンプルを調製しました。エナメルの bioapatite の解析は、サンプリング、一括または増分するかどうかの精度に依存します。この場合、異なる気候ゾーンからの考古学的なサンプル (2 つの羊) の結果を提示しました。増分サンプル羊第二大臼歯から分析し、ERJ (図 4) で始まるラベルします。増分サ?...

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Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

安定炭素・酸素同位体分析の炭酸塩のサンプリングと歯のエナメル質の前処理

人間と動物の歯のエナメル質炭酸の安定炭素・酸素同位体分析は、個々 の食事と環境復元のためのプロキシとして使用されています。ここでは、私たちは詳細な説明し、映像記録一括と順次歯エナメル質サンプリングとして考古学と古生物学的試料の前処理。

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

sampling-pretreatment-tooth-enamel-carbonate-for-stable-carbon-oxygen

Research

JoVE Journal

Biochemistry

13.8K ビュー.  Max Planck Institute for the Science of Human History. 人間と動物の歯のエナメル質炭酸の安定炭素・酸素同位体分析は、個々 の食事と環境復元のためのプロキシとして使用されています。ここでは、私たちは詳細な説明し、映像記録一括と順次歯エナメル質サンプリングとして考古学と古生物学的試料の前処理。

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A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. Moreover, even cultures of a single cell type may contain cells in distinct metabolic states, such as resting or cycling cells. Methods for measuring metabolic activities of such subpopulations are valuable tools for understanding cellular metabolism. Complex cell populations are most commonly separated using a cell sorter, and subpopulations isolated by this method can be analyzed by metabolomics methods. However, a problem with this approach is that the cell sorting procedure subjects cells to stresses that may distort their metabolism.
To overcome these issues, we reasoned that the mass isotopomer distributions (MIDs) of metabolites from cells cultured with stable isotope-labeled nutrients are likely to be more stable than absolute metabolite concentrations, because MIDs are formed over longer time scales and should be less affected by short-term exposure to cell sorting conditions. Here, we describe a method based on this principle, combining cell sorting with liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (LC-HRMS). The procedure involves analyzing three types of samples: (1) metabolite extracts obtained directly from the complex population; (2) extracts of "mock sorted" cells passed through the cell sorter instrument without gating any specific population; and (3) extracts of the actual sorted populations. The mock sorted cells are compared against direct extraction to verify that MIDs are indeed not altered by the cell sorting procedure itself, prior to analyzing the actual sorted populations. We show example results from HeLa cells sorted according to cell cycle phase, revealing changes in nucleotide metabolism.

This article describes a method for studying cellular metabolism in complex communities of multiple cell types, using a combination of stable isotope tracing, cell sorting to isolate specific cell types, and mass spectrometry.

安定同位体のトレースを使用した複雑な細胞のコミュニティのソートされた亜集団で代謝を測定する方法

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. ...

生化学

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications (PTMs). They are newly identified species with unknown means of establishment and functional implications. Current analytical methods are inadequate to detect the copy-specific occurrence of PTMs on the nucleosomal sister histones. This protocol presents a biochemical method for the in vitro reconstitution of nucleosomes containing differentially isotope-labeled sister histones. The generated complex can be also asymmetrically modified, after including a premodified histone pool during refolding of histone subcomplexes. These asymmetric nucleosome preparations can be readily reacted with histone-modifying enzymes to study modification cross-talk mechanisms imposed by the asymmetrically pre-incorporated PTM using nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Particularly, the modification reactions in real-time can be mapped independently on the two sister histones by performing different types of NMR correlation experiments, tailored for the respective isotope type. This methodology provides the means to study crosstalk mechanisms that contribute to the formation and propagation of asymmetric PTM patterns on nucleosomal complexes.

This protocol describes the reconstitution of nucleosomes containing differentially isotope-labeled sister histones. At the same time, asymmetrically post-translationally modified nucleosomes can be generated after using a premodified histone copy. These preparations can be readily used to study modification crosstalk mechanisms, simultaneously on both sister histones, by using high-resolution NMR spectroscopy.

示差同位体で標識された姉妹ヒストンとヌクレオソームの再構成

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Dissection of Human Retina and RPE-Choroid for Proteomic Analysis

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular choroid layer. Different regions of the retina are anatomically and molecularly distinct, facilitating unique functions and demonstrating differential susceptibility to disease. Proteomic analysis of each of these regions and layers can provide vital insights into the molecular process of many diseases, including Age-Related Macular Degeneration (AMD), diabetes mellitus, and glaucoma. However, separation of retinal regions and layers is essential before quantitative proteomic analysis can be accomplished. Here, we describe a method for dissection and collection of the foveal, macular, and peripheral retinal regions and underlying RPE-choroid complex, involving regional punch biopsies and manual removal of tissue layers from a human eye.One-dimensional SDS-PAGE as well as downstream proteomic analysis, such as liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS), can be used to identify proteins in each dissected retinal layer, revealing molecular biomarkers for retinal disease.

The human retina is composed of functionally and molecularly distinct regions, including the fovea, macula, and peripheral retina. Here, we describe a method using punch biopsies and manual removal of tissue layers from a human eye to dissect and collect these distinct retinal regions for downstream proteomic analysis.

プロテオーム解析のための人間の網膜と網膜色素上皮・脈絡膜の解剖

The human retina is composed of the sensory neuroretina and the underlying retinal pigmented epithelium (RPE), which is firmly complexed to the vascular ...

Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). SM is a common sphingolipid composed of a phosphorylcholine and a ceramide as the hydrophilic and hydrophobic component, respectively. A number of SM species are present in mammalian cells due to a variety in the sphingoid long chain base (LCB) and an N-acyl moiety in the ceramide. In this report, we show a method of estimating the number of carbon and double bonds in a LCB and an N-acyl moiety based on their corresponding product ions in MS/MS/MS (MS3) experiments. In addition, we present a quantitative analysis method for SM using two stable isotopically labeled SM species, which facilitates determining the range used in SM quantitation. The present method will be useful in characterizing a variety of SM species in biological samples and industrial products such as cosmetics.

Here, we present a protocol to quantify and qualify each sphingomyelin species using multiple reaction monitoring and MS/MS/MS mode, respectively.

同位体 2 つの安定を用いる液体クロマトグラフィー質量によってスフィンゴミエリンの定量的および定性的な方法ラベル スフィンゴミエリン種

We present a method of analyzing sphingomyelin (SM) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass ...

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM c-Cyts) has recently emerged as a novel whole-cell analytical method to characterize the bacterial electron transport from the respiratory chain to the cell exterior, referred to as the extracellular electron transport (EET). While the pathway and kinetics of the electron flow during the EET reaction have been investigated, a whole-cell electrochemical method to examine the impact of cation transport associated with EET has not yet been established. In the present study, an example of a biochemical technique to examine the deuterium kinetic isotope effect (KIE) on EET through OM c-Cyts using a model microbe, Shewanella oneidensis MR-1, is described. The KIE on the EET process can be obtained if the EET through OM c-Cyts acts as the rate-limiting step in the microbial current production. To that end, before the addition of D2O, the supernatant solution was replaced with fresh media containing a sufficient amount of the electron donor to support the rate of upstream metabolic reactions, and to remove the planktonic cells from a uniform monolayer biofilm on the working electrode. Alternative methods to confirm the rate-limiting step in microbial current production as EET through OM c-Cyts are also described. Our technique of a whole-cell electrochemical assay for investigating proton transport kinetics can be applied to other electroactive microbial strains.

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Here we present a protocol of whole-cell electrochemical experiments to study the contribution of proton transport to the rate of extracellular electron transport via the outer-membrane cytochromes complex in Shewanella oneidensis MR-1.

電気化学検出の重水素速度論的同位体効果シェワネラ oneidensis氏 1 の細胞外電子輸送

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine and remain largely unknown. With recent advances in single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) shedding light on the structural features of agonist binding sites and the activation mechanism of several ion channels, the stage is set for an in-depth dynamic analysis of their gating mechanisms using spectroscopic approaches. Spectroscopic techniques such as electron paramagnetic resonance (EPR) and double electron-electron resonance (DEER) have been mainly restricted to the study of prokaryotic ion channels that can be purified in large quantities. The requirement for large amounts of functional and stable membrane proteins has hampered the study of mammalian ion channels using these approaches. EPR and DEER offer many advantages, including determination of the structure and dynamic changes of mobile protein regions, albeit at low resolution, that might be difficult to obtain by X-ray crystallography or cryo-EM, and monitoring reversible gating transition (i.e., closed, open, sensitized, and desensitized). Here, we provide protocols for obtaining milligrams of functional detergent-solubilized transient receptor potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) that can be labeled for EPR and DEER spectroscopy.

This article describes specific methods to obtain biochemical quantities of detergent-solubilized TRPV1 for spectroscopic analysis. The combined protocols provide biochemical and biophysical tools that can be adapted to facilitate structural and functional studies for mammalian ion channels in a membrane-controlled environment.

精製と TRPV1 の分光学的解析のための再構成

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the importance of 3-dimensional (3D) cellular assemblies in these fields. Artificial scaffolds have often been used to construct 3D cellular assemblies. However, the scaffolds used to construct cellular assemblies are sometimes toxic and may change the properties of the cells. Thus, it would be beneficial to establish a non-toxic method for facilitating cell-cell contact. In this paper, we introduce a novel method for constructing stable cellular assemblies by using optical tweezers with dextran. One of the advantages of this method is that it establishes stable cell-to-cell contact within a few minutes. This new method allows the construction of 3D cellular assemblies in a natural hydrophilic polymer and is expected to be useful for constructing next-generation 3D single-cell assemblies in the fields of regenerative medicine and tissue engineering.

We demonstrate a novel method for constructing a single-cell-based 3-dimensional (3D) assembly without an artificial scaffold.

人工足場なしの安定した 3 D 携帯電話アセンブリを構築する細胞を操作します。

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic purification methods. This manuscript illustrates the technical details involved in the anaerobic purification process, including the preparation of buffers and reagents, the methods for column chromatography in a glove box, and the desalting of the protein prior to kinetics. Also described are the methods for preparing and using an oxygen electrode to perform kinetic characterization of an oxygen-utilizing enzyme. These methods are illustrated using the dioxygenase enzyme DesB, a gallate dioxygenase from the bacterium Sphingobium sp. strain SYK-6.

Here we present a protocol for anaerobic protein purification, anaerobic protein concentration, and subsequent kinetic characterization using an oxygen electrode system. The method is illustrated using the enzyme DesB, a dioxygenase enzyme which is more stable and active when purified and stored in an anaerobic environment.

嫌気性蛋白質の浄化および DesB ジオキシゲナーゼ活性と抑制の勉強用酸素電極による速度論的解析

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the progression of cancer, diabetes, neurodegeneration, and aging to name a few. For instance, changes in mitochondrial activity, the cell&#39;s metabolic powerhouse, have been characterized in many such diseases. Generally, the oxygen consumption rates of mitochondria were considered a reliable readout of mitochondrial activity and measurements in some of these studies were based on isolated mitochondria or cells. However, such conditions may not represent the complexity of a whole tissue. Recently, we have developed a novel method that enables the dynamic measurement of oxygen consumption rates from whole isolated fly heads. By utilizing this method, we have recorded lower oxygen consumption rates of the whole head segment in young versus aged flies. Secondly, we have discovered that lysine deacetylase inhibitors rapidly alter the oxygen consumption in the whole head. Our novel technique may therefore aid in uncovering new properties of various drugs, which may impact metabolic rates. Furthermore, our method may give a better understanding of metabolic behavior in an experimental setup that more closely resembles physiological states.

Measuring alterations in metabolic rates is central to understanding the progression of various diseases and aging. Here, we present a novel technique to measure whole head oxygen consumption that more closely resembles the physiological state and may aid in revealing novel drugs that modify mitochondrial activity.

測定と酸素消費量全体の解釈飛ぶ頭セグメント

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. The various functions of these cells are related to their activation states, which is also called polarization. The precise molecular description of these various polarizations is a priority in the field of macrophage biology. It is currently acknowledged that a multidimensional approach is necessary to describe how polarization is controlled by environmental signals. In this report, we describe a protocol designed to obtain the proteomic signature of various polarizations in human macrophages. This protocol is based on a label-free quantification of macrophage protein expression obtained from in-gel fractionated and Lys C/trypsin-digested cellular lysis content. We also provide a protocol based on in-solution digestion and isoelectric focusing fractionation to use as an alternative. Because oxygen concentration is a relevant environmental parameter in tissues, we use this protocol to explore how atmospheric composition or a low oxygen environment affects the classification of macrophage polarization.

We present a protocol to obtain proteomic signatures of human macrophages and apply this to determination of the impact of a low oxygen environment on macrophage polarization.

低酸素環境下におけるヒトのマクロファージ偏光のプロテオーム解析

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

安定炭素・酸素同位体分析の炭酸塩のサンプリングと歯のエナメル質の前処理

要約

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安定同位体のトレースを使用した複雑な細胞のコミュニティのソートされた亜集団で代謝を測定する方法

示差同位体で標識された姉妹ヒストンとヌクレオソームの再構成

プロテオーム解析のための人間の網膜と網膜色素上皮・脈絡膜の解剖

同位体 2 つの安定を用いる液体クロマトグラフィー質量によってスフィンゴミエリンの定量的および定性的な方法ラベルスフィンゴミエリン種

電気化学検出の重水素速度論的同位体効果シェワネラ oneidensis氏 1 の細胞外電子輸送

精製と TRPV1 の分光学的解析のための再構成

人工足場なしの安定した 3 D 携帯電話アセンブリを構築する細胞を操作します。

嫌気性蛋白質の浄化および DesB ジオキシゲナーゼ活性と抑制の勉強用酸素電極による速度論的解析

測定と酸素消費量全体の解釈飛ぶ頭セグメント

低酸素環境下におけるヒトのマクロファージ偏光のプロテオーム解析

安定炭素・酸素同位体分析の炭酸塩のサンプリングと歯のエナメル質の前処理

要約

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安定同位体のトレースを使用した複雑な細胞のコミュニティのソートされた亜集団で代謝を測定する方法

示差同位体で標識された姉妹ヒストンとヌクレオソームの再構成

プロテオーム解析のための人間の網膜と網膜色素上皮・脈絡膜の解剖

同位体 2 つの安定を用いる液体クロマトグラフィー質量によってスフィンゴミエリンの定量的および定性的な方法ラベル スフィンゴミエリン種

電気化学検出の重水素速度論的同位体効果シェワネラ oneidensis氏 1 の細胞外電子輸送

精製と TRPV1 の分光学的解析のための再構成

人工足場なしの安定した 3 D 携帯電話アセンブリを構築する細胞を操作します。

嫌気性蛋白質の浄化および DesB ジオキシゲナーゼ活性と抑制の勉強用酸素電極による速度論的解析

測定と酸素消費量全体の解釈飛ぶ頭セグメント

低酸素環境下におけるヒトのマクロファージ偏光のプロテオーム解析

同位体 2 つの安定を用いる液体クロマトグラフィー質量によってスフィンゴミエリンの定量的および定性的な方法ラベルスフィンゴミエリン種