この方法は、老化の過程で代謝活性がどのように変化するかを代謝分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、古典的なミトコンドリア分離と比較して自然および生理学的状態に近いデータを持つ無傷の身体セグメントの使用である。この手順を実証するには、私の研究室の卒業生であるアヌループとアニカです。
プロトコルを開始するには、実験を開始する1時間前にマシンの電源を入れ、所望の温度に達して安定した状態を保つために十分な時間を確保します。次に、ソフトウェアのセットアップで、管理モードで、カートリッジキャリブレーションの長さと所望の温度を選択します。次に、次のプロトコルを入力します:実験計画に応じて、選択した測定ステップの後にポートAからDへの注入ステップを追加します。
基礎OCRの品質と決定を確認するには、ポートA.Preを介して最初の薬剤の注入を設定する前に、少なくとも3つの測定サイクルのプロトコルを調整し、各ウェルに1.0ミリリットルのキャリブラントを追加して、1日、またはテストの少なくとも4時間前にカートリッジを校正し、プレートの上にセンサーカートリッジを置きます。蒸発を防ぐために24時間以上の水和が予定されている場合は、カートリッジをParafilmで覆います。カートリッジはCO2なしで摂氏37度で一晩保管してください。
次に、実験薬を新鮮な培地に完全に溶解し、2.5%グルコースを加えて確実にする。所望の温度で車両のpHに薬剤溶液のpHを測定し、調整する。ピペット薬溶液は、それに割り当てられた注射ポートです.
次に、カートリッジをマシンにロードし、キャリブレーションを開始します。1つの正常なHClで望ましいpHに作りたての培地に2.5%のグルコースを加えて調節してください。次に、アイスボックスを準備し、氷の上に金属板を置きます。
アイレットプレートパッケージを開きます。16ミリメートルペトリ皿でメディアに網を浸します。インサータで1つのネットを収集し、インサーターを顕微鏡の隣に立たします。
インサータに接続されたネットに、少量のメディアを追加します。その後、ハエを氷冷金属板に置いて麻酔します。鉗子を使用して、ハエの腹部をつかみ、顕微鏡下のペトリ皿にメディアに浸します。
2 つ目の鉗子を使用して、ハエの頭部をそっと取り外します。インサータに取り付けたネットの中央にヘッドを置き、ヘッドがメディアに浸かっていることを確認します。井戸に置いている間に頭を失うことを避けるために頭を中心にする前に余分な流体を取り除きます。
ネット上に16の頭がある場合は、それらを中央に配置します。インサータを使用して、井戸にネットを置きます。ヘッドがネットの下に閉じ込められていることを確認し、ゆっくりと700マイクロリットルの培地と2.5%のグルコースを加えます。
背景に使用される空の井戸には、バッファの700マイクロリットルに2.5%のグルコースを加えたネットも含まれていることを確認してください。マイクロスコープを介してネットの下の気泡の井戸を確認してください。ピペットは、1ミリメートルのピペットを使用して優しく上下に泡を取り除きます。
信頼性の高いOCR読み取りのためにヘッドを中心に保ちます。次に、プレートを機械に加え、測定を開始します。プロトコルの最後で、カートリッジを取り外します。
ポートの詰め物に目に見える残り物がないことを視覚的に確認します。次に、ヘッドがタンパク質抽出に使用されない場合は、カートリッジとプレートを廃棄します。分析の前に異常な井戸を検出するために、酸素とpHレベルを見ることを忘れないでください。
さらに、酸素レベルに基づいて適切な酸素消費率計算を選択することが重要です。プロトコルを実行すると、ミッドライフヘッドの酸素レベルが若いフライヘッドよりも速く低下することが観察されました。酸素レベルの範囲が条件間で類似している場合は、AKOSアルゴリズムを使用して自動的に酸素消費速度を生成する方が良いです。
KDAC阻害剤であるバニレートナトリウム(SB)の添加は、酸素レベルのダイナミクスを一時的に変化させる。車両コントロールは最初と最後のティックの間に酸素の安定したレベルを表示するのに対し、SBの付加はこれらのダニの酸素レベルのかなりの一時的な低下を引き起こす。AKOS 計算はすべてのティックを考慮し、無酸素状態を無視するため、ポートAの注入時にほとんど変化を示さない正規化されていないAKOSベースのOCRレベルで観察されるように、誤解を招くOCRを生成します。
この手順を試みる際には、1枚のプレートを準備するために相対的に短い時間を確保するために、2人の人と一緒に作業することが重要です。この手順に従って、ウェスタンブロットおよび質量分析などの他の生化学的方法は、分子機構に関連する質問、例えば、中等度の代謝変化を行うために行うことができる。
