マウス肺腺癌細胞を同種移植片レシピエントに移植する正交性移植により、生理学的条件下で完全に活性な免疫系の存在下での腫瘍形成の研究が可能になる。もちろん、腫瘍は免疫能力マウスに発展し、免疫不全マウスで移植を行う場合ははるかに生理学的です。移植前の腫瘍細胞の遺伝子編集は、このモデルを腫瘍成長および遺伝子発現プロファイルに対する遺伝的要因の影響を研究するための直接的かつ時間を節約するアプローチにする。
誘導性オートチソナス肺腫瘍モデルと比較して、この方法はマウスの広範な繁殖を回避し、したがって、以前の肺癌マウスモデルの改良を表す。手順を開始する前に、はさみを使用してカテーテル針の端部を取り除き、カテーテルを針の端に完全に押し込みます。つま先ピンチに対する応答の欠如を確認した後、麻酔下の8〜12週齢のマウスの目に軟膏を塗布し、縫合糸に垂直な胸部を持つ挿管プラットフォームを横切って縫合糸の文字列の上切開部をフックします。
前肢の間に光ファイバーケーブルを置いて胸を照らし、消毒された平らな鉗子を使って舌を慎重に開けます。白色光の放出を探して喉頭、喉頭蓋、およびアリュテノイド軟骨を見つけます。気管の開口部がはっきりと見える場合は、カテーテルを気管に静かにスライドさせ、分岐を超えて、肺内の肺腺癌細胞の均等な分布を保証する。
カテーテルの挿入が非常に滑らかであることを注意してください。抵抗を感じたら、カテーテルを取り外し、気管を再び露出して、マウスの怪我をしないようにします。針をカテーテルから素早く取り出し、カテーテルを通して白色光が光っているかどうかを確認します。
気管内のカテーテルの適切な配置を確認するには、カテーテルに水の1ミリリットルの注射器を取り付けます。注射器の水は呼吸に合うように急速に上下に動くはずです。細胞懸濁液を送達する前に、細胞を手で温め、50マイクロリットルの細胞をカテーテルに積み込みます。
懸濁液が吸引されるとすぐに、空の1ミリリットルの注射器をカテーテルに取り付け、300マイクロリットルの空気をカテーテルに分配して、肺内の腫瘍細胞の完全な分布を確保する。その後、カテーテルを静かに取り外し、完全な債務が発生するまで監視とヒートパッド上にマウスを置きます。適切な実験エンドポイントの後、70%エタノールに死体を浸し、解剖板に動物を固定します。
腹側の正中線切開を行い、皮膚をそっと反転して胸壁の筋肉と腹部の器官を露出させます。はさみを使って横隔膜を穿刺し、肋骨を切り、胸腔を露出させろ。左心室の小さな開口部を切断し、27ゲージの針を使用して、右心室を通して肺を3回穿孔し、1回の注入ごとに6〜8ミリリットルの氷冷PVSを使用します。
最後の灌流の後、肺は完全に血液を取り除き、白く見えるはずです。収穫後、はさみを使用して肺組織を小片にミンチします。肺の断片を摂氏37度で30~60分間の肺消化バッファー1.5ミリリットルを含む2ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移し、揺れ動かします。
消化の終わりに、70ミクロンの細胞ストレーナーを通して50ミリリットルのチューブに細胞懸濁液を移し、無菌10ミリリットルシリンジプランジャーの端を使用して、残りの組織断片をフィルターに押し込みます。2%FCSを補って、PVSの15ミリリットルでストレーナーをすすいでください。遠心分離により細胞を回収する。
ペレットを塩化アンモニウムカリウムリシスバッファーの1ミリリットルで室温で5分間インキュベーションし、再び遠心分離します。次に、2%FCSを補充したPVSの1ミリリットルで白血球ペレットを再中断し、実験プロトコルに従ってフローサイトメトリック分析のために細胞を染色する。予想通り、レシピエントマウスの生存は、生着細胞の数と相関している。
そして、死亡時に収穫された肺は、すべてのローブ全体で腫瘍結節の均等な分布を示す。自己性腫瘍を抱える肺の切片を、同種移植された肺腫瘍細胞に続く腫瘍と比較すると、形態学的差異は認められない。免疫担当マウスへの直交性腫瘍細胞移植の3週間後に単離された肺細胞のPD-L1発現のフロー細胞量分析は、ちょうど実証したように、PD-L1細胞表面マーカー発現におけるアップレギュレーションを明らかにし、インビトロ培養肺腫瘍細胞と比較した。
整形移植後、免疫物質化学分析、および追加の実験的な問題に対処するためのmRNAプロファイリングを含む他の分析方法を適用することができる。
