マイクロ流体技術に基づいて、正常な血液細胞からのCTCの単離および特性評価は、特定のCTCバイオマーカーの使用を必要とせず、細胞培養と互換性があります。このプロトコルは、CTC抽出の高い率を容易にし、悪性細胞形態学的特性を評価することによって、CTCの広範な細胞学的分析を提供する。CTCによるPD-L1発現は、肺癌管理において予測値を有する。
このテストを用いた検出の改善は、長期的により良い患者管理を促進することができる。このプロトコルの他のアプリケーションには、FISHを使用して遺伝的収差を検出すること、またはCTC上でトランスクリプト分析を行うだけでなく、母親の胎児起源の細胞を単離することが含まれます。手順を実証することは、私たちの研究室の技術者ジュリー・バランディエです。
前分析循環腫瘍細胞の濃縮のために、最初に7.5ミリリットルの血液をEDTAカリウムチューブに集め、細胞沈殿や凝固を避けるためにサンプルを穏やかな攪拌下に保ちます。採取から6時間以内に、微生物安全キャビネットの下で血清学的ピペットを使用して、最大7.5ミリリットルの全血を新しい50ミリリットル遠心管に移し、室温で1600倍Gで10分間遠心分離します。遠心分離の終わりに、伝達ピペットを使用して、バフィーコートを乱すことなくプラズマ画分を収集し、同等のPBSの体積でプラズマを7.5ミリリットルまで希釈します。
次に、血液サンプルに赤血球のリシスバッファーを慎重に加え、最終体積の30ミリリットルにし、採取管を3回軽く反転してから、チューブを室温で10分間置く。インキュベーションの終わりに、遠心分離によって細胞を収集し、慎重に上清の最後の4〜5ミリリットルを除くすべてを除去します。フィルター処理されたマイクロピペットを使用して残りの上清を除去し、フィルターチップ付きのP1000マイクロピペットを使用して、チューブの壁に1ミリリットルの再懸濁液バッファーを追加します。
気泡を導入しないように、サンプルが均質になるまで、穏やかなピペットで細胞ペレットを再懸濁します。ペレットが再懸濁されたら、気泡を導入することなく、チューブの壁に3ミリリットルの再懸濁液を加え、細胞を再び穏やかに混合します。スパイラルマイクロ流体デバイス循環腫瘍細胞濃縮のために、まず新しいスパイラルマイクロ流体チップをデバイスにロードし、空の50ミリリットル遠心管を各入力および出力ポートにロードします。
素数をクリックして、スパイラルマイクロ流体デバイスを3分間プライムします。サイクルの最後に入力および出力チューブを取り外す。再中断した血液サンプルを入力ポートにロードし、明確な15ミリリットルの円錐チューブを出力ポートにロードします。
次に実行をクリックし、プログラム3を選択して31分間の循環腫瘍細胞濃縮プログラムを開始します。サイクルの終わりには、遠心分離機に出力チューブを転送し、上清の最後の2ミリリットルを除くすべてを除去するために5ミリリットル血清ピペットを使用します。その後、上清の最後の100マイクロリットルを除くすべてを除去するためにマイクロピペットを使用してください。
免疫蛍光染色の場合、血球計で細胞を数え、濃縮したサンプルを0.2%抗結合溶液濃度の100マイクロリットル当たり10倍から5番目の細胞に希釈します。次に、50マイクロリットルの抗結合溶液を浸した綿棒を使用して、サンプルチャンバーの輪郭を湿らせ、サンプルチャンバにポリリジンガラススライドを置く。チャンバーを閉じ、ピペットを3回上下して、上清の最後の100マイクロリットルでサンプルを再懸濁する前に、結合溶液でマイクロピペットチップをコーティングする。
細胞溶液をサンプルチャンバーに移し、サンプルを4分あたり400回転で、低加速度で専用遠心分離機で細胞回転します。遠心分離の終わりに、堆積物の領域の周りにシリコーンアイソレーターを置き、微生物学的安全キャビネットの下でスライドを2分間乾燥させ、その後、サイトスパンサンプルを室温で10分間4%パラホルムアルデヒドの100マイクロリットルで固定し、続いて1回200マイクロリットルのPBSを室温で洗浄して3分間洗浄します。最後の洗浄後、室温でのブロッキング試薬で30分間インキュベーションを行い、その後、目的の抗体溶液を100マイクロリットルで標識して非特異的結合をブロックする。
ラベル付きスライドを100%15ミリリットルのシャーレに2ミリリットルの無菌水で湿らせた吸収性紙の上に置き、皿を一晩摂氏4度で閉じ、光から保護します。翌朝、サンプルをPBSで3回洗浄し、適切な取り付け溶液とガラスカバースリップを10マイクロリットルで取り付けます。その後、カバースリップを透明なマニキュアで密封します。
細胞球菌サンプルを画像化するには、X Y電動プラットフォームを備えたストレート蛍光顕微鏡にスライドをロードし、抗体標識に使用するフルオロフォアに従って20倍の目的と適切なチャネルを選択します。水銀ランプをオンにし、顕微鏡と関連ソフトウェアを半自動撮影に適応させます。ランプの準備ができたら、取得メニューで 4 つのチャンネルを定義し、露出時間を設定し、スキャンするタイルを定義します。
タイルをクリックし、高度な実験を行い、スキャンする領域を定義します。次に、画面上のフォーカスを調整し、[実験の開始] をクリックします。実験の最後に、各チャネルの TIF ファイルをエクスポートし、サンプル、回数、仕分け、サブタイルの数を含むファイルに具体的に名前を付けます。
画像解析では、ブロードインスティチュートの Web サイトから画像解析ソフトウェアを開き、[ファイル]、[ファイルからのパイプライン]、[分析 4 つのチャネルの CTC] をクリックします。ファイルをファイル リストにドロップし、メタデータを更新して、タイルでファイルをグループ化します。次に、[画像を解析]をクリックして、計測強度パラメータに対応するスプレッドシートファイルを開きます。
最適化された除染プロトコルがなければ、わずか24時間後に濃縮されたA549細胞株の組織培養において高い細菌汚染が観察され、真核細胞の死および細胞形態変化を引き起こす。これに対して、洗浄プロトコルの後、生きたA549細胞は、10時間の組織培養および培地除去後の2D培養において、3D培養条件下、および患者試料内で得られる。細胞スピンを用いたポリリジン被覆スライド上の液体免疫蛍光染色アッセイまたは免疫蛍光染色アッセイを用いて、2つのアッセイ間に列挙される核の数の明確な区別が観察できる。
細胞スピンステップがなければ、非細胞スピン細胞の準備におけるぼやけた輪郭のために、白血球を腫瘍細胞から分化することは困難である。ここで異なる患者試料からの異なる代表的な所見が観察され、特に白血球の残存数が強く可変であると判断され、全血サンプルに依存する。また、得られた循環腫瘍細胞のサブ集団においても高い変動性が認められた。
細胞スピン上の各細胞は画像解析ソフトウェアによって識別され、細胞の追跡を可能にし、必要に応じて結果を手動で確認する。実際、パイロット分析は、手動列挙と画像解析ソフトウェアの列挙との間の一見を示しました。タンパク質抗体ハイブリダイゼーション用の社内設計の湿ったシャーレのセットアップは、デバイスがインキュベーション時間全体を通して十分に湿ったままであるため、非常に重要です。
