ダフネ Dambournet は、多くの洞察力に富んだ議論や編集、イラスト、原稿の批判的読解のアンジェ リーク ・ ネルソン、アンドリュー タッカー ラミン B1 セルのタグ付きの mEGFP ラインを生成するためのタオは遺伝子についてのアドバイスを感謝いたします。遺伝子の編集および品質管理プロセスへの貢献のため細胞科学の幹細胞と遺伝子編集とアレンの協会のアッセイ開発チームを確認したいです。私たちの細胞の遺伝子編集行を作成するために使用私たち WTC ラインは、グラッドス トーン研究所、UCSF でブルース ・ r ・ コンクリン研究所によって提供されました。我々 は細胞科学創設者、ポール g. アレン、励まし、彼のビジョンのためのアレンの協会に感謝し、サポートします。

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HiPSCs の蛍光タンパク質融合を規制内生を生成するため、ここで示す方法は、ライブセル イメージングから様々 な機能の研究に至るまでのアプリケーションと編集遺伝子細胞を生成するための汎用性と強力なアプローチと」患者由来による行13,14,15を使用して皿に病」モデル。それが潜在的モデルや正しい病気の原因となる変異22,23に他のタグまたは小さい遺伝の変更を導入して使用する中に、N または C-末端内因性のタンパク質の大きな FP タグを導入するこのメソッドを使用すると、.小さい挿入相同性の腕のサイズになることがありますが、このメソッドで提示を編集する一般的なアプローチは、24,25をかかることがあります。HiPSCs の使用が彼らの広大なユーティリティは、慎重に最適化と強くお勧めこのプロトコルは他の哺乳類セルラインのゲノムを編集するのには適応があります。
(マイクロ アレイまたは RNA シーケンス データ) から推定するトラン スクリプト豊富な FP がタグ付けに興味の遺伝子を識別するとき良いトラン スクリプトのレベルは常に相関がないが、遺伝子または関心のアイソ フォームを表明したかどうかを評価するためのポイントを始めています。蛋白質レベル。ここで説明されている FACS 濃縮方法が興味のセル型で少なくとも適度に表現される遺伝子の最高を仕事します。この戦略はまた、バック グラウンド強度比への信号が非常に低い12,19centrin、desmoplakin、paxillin など点状および/または離散の局在パターンを示す融合の選択で成功しています。遺伝子が高発現していないまたは派生セル型でしか表現が追加選定を必要があります。
ひと培養細胞で使用されるテンプレート プラスミド crRNA とドナーのデザインの出発点は、人間の参照ゲノム (GRCh38) をする必要があります。異なる培養細胞のゲノムは、同じ種の内で変わることができるので CRISPR/Cas9 はシーケンス固有セル行固有亜種 (一塩基多型または挿入/削除 (オクターリピート)) を識別するために非常に便利ですので参照ゲノムとは異なる、デザインにこれらを組み込みます。これにより crRNAs がホストのゲノムに互換性があること、ドナー テンプレート プラスミド ホモロジー腕が任意のセル行の特定のバリアントが保持されます。推奨される戦略は、設計プロセス中に crRNAs とドナーのテンプレート プラスミド ホモロジー腕にホモの亜種を組み込むことです。ヘテロ接合体の変形を組み込むことはオプションです。大きなノックアウトの実験のため特定の試薬を使用し、このプロトコルの他主な考慮事項を以下に。
Cas9 タンパク質
Cas9 蛋白質を使用しての主な利点は、Cas9 を導入して、RNP 複合として gRNA は、Cas9 と gRNA の発現が数日間続く可能性があり、つながるプラスミド ベースのアプローチと比較してのヌクレアーゼ活性の限られた期間での結果に示されています。大きいとオフ-対象活動26,27。Cas9 蛋白質を使用しての追加の利点は、劈開は一度細胞の中にすぐに利用できることです。これより従来の Cas9 mRNA または Cas9/gRNA プラスミドを使用して転写、翻訳、タンパク質のプロセッシング26,28を必要とするとは対照的します。野生型ピオゲネス s. Cas9 蛋白質が多く商業ソースから可能です。
ガイド RNA
目的の FP 挿入部位付近の crRNA ターゲットがターゲットを持つゼロまたは数予測をオフ - ホストのゲノム29,30,31,32を見つけるための多くの公開ツールがあります。HDR と HDR 結果の精度の効率は、crRNA ターゲット特定の軌跡12で使用によって大きく異なります。このため、いくつかの crRNAs をテスト (2-4、できれば 50 以内に目的の挿入部位の bp) 軌跡あたりは、これは編集の実験が成功の確率を高める可能性がありますので勧め。GRNA を提供するための現在の可能性を含める合成 2 部 crRNA と tracrRNA、合成単一 gRNAs (sgRNAs)の in vitro転写 sgRNAs、または U6 プロモーターから sgRNA を発現する細胞にプラスミドを提供します。このプロトコルは高い切断活性の最適化されていません。そのまま 2 部の crRNA と tracrRNA (材料表参照) は、セルに少なくとも潜在的な摂動を起こしながらモノラル対立 FP タグ セルラインを生成することを目標に使用されました。
ドナー テンプレート プラスミド
相同性のいくつか腕シーケンスを提供ドナー テンプレート プラスミドが HDR イベント中に宿主ゲノムに組み込まれます、ため crRNA 認識部位に点突然変異を導入次の HDR Cas9 で胸の谷間をさらに防ぐためするべき。通常最も簡単な分裂的な変更は PAM シーケンスを変異です。いくつかの非正規の PAM のシーケンスは、野生型ピオゲネス s. Cas9 でまだ認識できる、ために、NGG、NAG、NGA の33を使用しないようにすることをお勧めします。相同性腕を変異、非同義変異とまれなコドンの導入を避けます。PAM シーケンスに同義的な変化は不可能、種地域で 3 つの同義の点突然変異をすることを検討 (10 bp PAM に近位) crRNA 結合部位の。これらの地域は重要な規制シーケンスを含めることができますので、5ʹ 非翻訳領域 (UTR) でこれらの変更を行うときに十分な注意が必要があります。コンサルティングの遺伝的保全データベース UCSC のゲノムのブラウザー比較ゲノミクスのトラックは、これらのケースでのガイダンスを提供できるよう非常に節約された拠点17への変更よりも、非保存の拠点への変更より良い容認されるかもしれない。FP シーケンスの単なる挿入がある (図 1) のように crRNA 結合部位を破壊する十分なただし、新しく追加されたシーケンスは crRNA バインディングおよび PAM シーケンスの永続化のためにチェックしなければなりません。
FP とネイティブ蛋白質のアミノ酸のリンカーが融合蛋白質34の機能を節約するためにお勧めします。多くの場合特定料金のサイズ アミノ酸リンカーを選択可能性があります。場合は内因性にターゲットを絞ったようなデザイン cDNA 融合融合タンパク質よく研究されている、CRISPR/Cas9 ノックアウトの実験12,19同じリンカー シーケンスが使えます。このような情報を使用できない場合は、GTSGGS などの短いリンカーもされて正常に12を使用します。他の研究は、さまざまなターゲット35の汎用小型 3-アミノ酸リンカー順序との成功を実証しています。
トランスフェクションと FACS 濃縮
多くの市販のトランスフェクション試薬は、エレクトロポレーション システムを使用するサイズ、料金、および構成の広い範囲で試薬を提供することができますに対し分子の特定の種類の細胞への配信のため処方されています。HiPSCs ようにセルに transfect ハードの一般的なトランスフェクション法に加えて、エレクトロポレーションはまたこのメソッドで説明されているように CRISPR/Cas9 を介した FP ノックのすべての 3 つのコンポーネントを提供することの利点を運ぶ。トレーシー ・ メソッド (データは示されていない)、また RNP 配信26,28,36 の他のユーザーによって使用されていますと、他の市販試薬と比較して最高の結果を生成するエレクトロポレーションが見つかりました.
HiPSCs を編集するため、このプロトコルを使用する場合、特別な注意は編集プロセスの最適な細胞生存率と最小限の分化遺伝子の前後にセルの穏やかな取扱いの確保にすべき。特に、FACS 濃縮方法が最大ノズル可能 (130 μ m)、低流量 (24 μ L/分)、防腐剤フリー シース液を用いて幹細胞を並べ替えに適応する必要があります (生理食塩水など材料の表を参照)、および低いサンプル圧力 (10 psi)。幹細胞の最適生存率の結果、並べ替え、単一のセルではなく FACS 濃縮 hiPSCs が一括で並べ替えられ、細胞の生存率と幹細胞の整合性を最適化する人口として展開します。ただし、単一セルの並べ替えが以下の敏感な細胞のタイプの適切なあります。細胞の生存を促進するため、細胞は FACS 濃縮のため収穫後 1 時間よりは、もはや文化に戻り、並べ替えプロセス全体を通じて室温で保管します。いくつかの細胞の種類、細胞の生存は並べ替えプロセスを通して氷 (4 ° C) の上のインキュベーターの細胞によって強化があります。
FP 陽性細胞の一括拡大は、系統を生成する前に融合蛋白質のローカリゼーションのための画像解析による人口を評価する機会を提供します。セルの結果豊かな人口は、いくつかの研究のために十分かもしれないが、これらの集団はよく FP 様々 な強度の信号を表示します。分離系統機能実験12のより適切な意思統一信号 (図 3) があります。
クローンの細胞ラインの生成
編集とクローン線の生成処理中、細胞の形態を監視することが重要です。フィーダー無料条件で栽培による植民地は、滑らかなエッジとも、十分に詰めてセンター12,18,19を表わすべきであります。分化した細胞は、文化の 5% 未満で観察すべき。個々 のコロニーを選ぶとき、それらにその展示形態を選択します。イベントを継 96 ウェル プレート、中に形態のためのクローンをチェックし、これが差別化につながるや遺伝的不安定性の徴候である可能性がありますが大きくなり過ぎたものを中止します。
クローンの細胞ラインの生成できる遺伝確認正確な編集のため Cas9 誘起二重鎖切断がゲノムのために重要なある頻繁に修復される不正確定款目的の軌跡でタグにもかかわらず。前述の PCR アッセイことを示した累積 10 ユニークなゲノム遺伝子座の間で多く (45%) FP 発現クローンのゲノム12ドナー プラスミド バックボーン統合対象の座または (稀に) ランダムに苦しみました。また、GFP 陽性の 23% のクローンを作成 (n = 177) 10 ユニークな遺伝子座の間で、またはタグなしの対立遺伝子、NHEJ12可能性があります予想される crRNA 切削現場近くの突然変異を隠すことがわかった。多くの系統 (~ 100 クローン/編集) のこの遺伝子解析 FP 式と単独で予想される融合蛋白質のローカリゼーションは正確な編集12 には保証しないので、細胞集団では不可能です遺伝検証の重要性を強調しました。.さらに、これらの PCR に基づく試金は、有意義な分析が完了する前に系統発生の必要性を正当化、確実に細胞の豊かな人口に実行できません。挿入された FP タグの遺伝学的確認と (モノラル対立編集したクローン) で未編集の対立遺伝子の遺伝的整合性の検証は、タグ式を超えてターゲットの軌跡で正確な編集を確認する必要です。
Bi 対立編集率が低いと (サンガーとエキソーム配列によって試金) としてターゲットを突然変異の欠如は、この方法で (未発表データ)12を使用して、日付に観察されています。これは、CRISPR/Cas9 実験26,27短期持続 RNP の使用を記述する先行研究と一致。Bi 対立編集クローン細胞の欠如特定の軌跡がありますまたはセルの 2 つを容認することができないのためと推定される bi 対立編集されたセルがあった以前に公開された実験の重要な蛋白質のコピー タグ別 (TUBA1B)12が、一つの座 (LMNB1) の観察。Bi 対立の完全に検証されたクローン細胞株は、mEGFP19このメソッド タグ ST6 β-ガラクトシド α 2, 6 シアル酸転移酵素 1 (ST6GAL1) および RAB5A メンバー RAS 癌遺伝子家族 (RAB5A) を使用して生成されています。
ゲノムの編集の精度を確認し、超えてさらにクローン線を特徴付けるし、満たすすべての幹細胞、ゲノム、クローンの識別に使用することができます品質管理試金の様々 ながあるし、細胞生物学的基準は研究を将来的に使用.細胞生物学・機能の試金を使用して、適切な表現、ローカリゼーション、および融合タンパク質12の機能を確認できます。未編集のペアレンタル コントロールに比較は、編集プロセスのローカリゼーション ・動態・機能に及ぼす影響の評価に役立ちます。他のアッセイなど成長解析とゲノム安定性をテストすることができますは、タグ付きタンパク質がセルに摂動かどうか。使用すると、このプロトコルでは、多能性マーカーと微分の潜在性の評価が下流の貴重なクローン研究12を決定する際に重要なことができます。文化を拡張したため、遺伝的不安定性、成長率を監視していくことが示されているし、クローン細胞の染色体はまた重要な12,37。ただし、最終的なもの編集されたセルの使用レベルと幅広い品質管理分析が最終的に決定して、アプリケーションによって異なります。

ゲノム編集戦略、細胞プロセスを研究に CRISPR/Cas9 特にの使用になってますますアクセスし貴重な1,2,3,4,5,6,7. CRISPR/Cas9 の多くのアプリケーションの一つは、遺伝子やタンパク質製品8 の活動のためのレポーターとして特定のゲノム遺伝子座に GFP など大規模な外因性シーケンスの (監督ホモロジー修理 (HDR)) で導入.この手法を使用して、内局と5 興味の蛋白質のダイナミクスを可視化する結果の内生的規制の融合蛋白質を使用できます。、内因性の開いたリーディング ・ フレームに蛍光タンパク質シーケンスに参加できます。 ,6,9,10,11。タグ内因蛋白質過剰発現システムに比べて多くの利点を提供して、人間のゲノムの大規模なシーケンスの挿入は通常選択範囲または濃縮可能なセルの人口を得るために戦略を求めて非効率的なプロセス簡単に学ぶ5,12であります。
このプロトコルでは、目的の genomic 位置に蛍光タンパク質 (FP) をエンコードの DNA シーケンスの挿入について説明します。プロトコルには、デザインとドナー テンプレート プラスミッドおよび複雑なリボ核タンパク質 (RNP) の配信 (野生型ピオゲネス s. Cas9 タンパク質合成の CRISPR RNA (crRNA) とトランス活性化 crRNA (tracrRNA)) が含まれています。述べる推定編集した細胞蛍光性によって作動セル (FACS) を並べ替えおよび細胞ラインの生成プロセスの充実です。日には、このメソッドは、エピジェネティックまたは (稀に) bi 対立緑色蛍光タンパク質 (GFP) タグ分類主要な細胞構造を表す 20 5 蛋白質によるラインを生成する使用されています。これらの努力からの結果の編集されたセルは、予想される遺伝的挿入、正しくローカライズの融合蛋白質を表現、多能性と安定した染色体12 (と未発表のデータ) を維持確認されています。このメソッドは、他の複数の生成にも使用されていますシングルとデュアル (同じセルにタグ付きの 2 つの異なる蛋白質) 編集 hiPSCs (未発表データ) の集団。
多くの従来の細胞とは異なり彼ら、二倍体、karyotypically ので安定性非変形、増殖性健康なドナー由来ヒト Ips はこれらのゲノム編集の努力のため選ばれました。これらのプロパティは、基本の細胞生物学と疾患モデリングを勉強するため魅力的なモデルを提供します。なお、hiPSCs の微分の潜在性は様々 な系統、同質細胞オルガノイド、組織「皿に病気」モデル13 などを用いたセル型並列で複数の発達段階を研究する機会を提供します ,14,15。このプロトコルは hiPSCs (WTC 線) の開発は、他の哺乳類セルラインを使用してプロトコルの開発のために有益かもしれません。

<table><tbody><tr><td>Geneious R9</td><td>Biomatters, or similar</td><td></td><td>bioinformatics software for&lt;em&gt; in silico&lt;/em&gt; donor plasmid design</td></tr><tr><td>TE Buffer pH 8.0</td><td>IDT, or similar</td><td>11-01-02-05</td><td></td></tr><tr><td>HERAcell VIOS 160i CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator, or similar</td><td>ThermoFisher Scientific, or similar</td><td>51030408</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes (1000 &amp;micro;L, 200 &amp;micro;L, 20 &amp;micro;L, 10 &amp;micro;L, 2 &amp;micro;L)</td><td>Rainin, or similar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips (1000 &amp;micro;L, 200 &amp;micro;L, 20 &amp;micro;L)</td><td>Rainin, or similar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multi-channel Pipette (200 &amp;micro;L)</td><td>Rainin, or similar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serological pipetes (25 mL, 10 mL, 5 mL)</td><td>Costar, or similar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BRAND 8-Channel Manifold for Quiksip, Autoclavable</td><td>Millipore Sigma, or similar</td><td>BR704526-1EA</td><td>use with non-filtered pipet tips, such as Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10, below</td></tr><tr><td>Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10</td><td>Thermo Fisher, or similar</td><td>3501-05</td><td></td></tr><tr><td>XP2 Pipette Controller</td><td>Drummond, or similar</td><td>4-000-501</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Pasteur Pipets</td><td>VWR, or similar</td><td>53300-567</td><td></td></tr><tr><td>Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet</td><td>CELLGARD, or similar</td><td>NU-481</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>lot tested before use with hiPSC</td></tr><tr><td>DMEM/F12 (-phenol red)</td><td>Gibco</td><td>11039-021</td><td>cold, for diluting Matrigel 1:30</td></tr><tr><td>mTeSR1 Complete Media</td><td>StemCell Technologies</td><td>85850</td><td>recommended growth media for WTC hiPSC line</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>WTC hiPSC line</td><td>Coriell</td><td>GM25256</td><td>the hiPSC line used in this protocol is available through Coriell</td></tr><tr><td>Tissue culture dish 100 mm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>6-well Cell Culture Plate</td><td>CELLSTAR</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase</td><td>Gibco</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline (DPBS) no calcium, no magnesium</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>15 mL polystyrene conical</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.100</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (ROCK Inhibitor)</td><td>StemCell Technologies</td><td>72308</td><td></td></tr><tr><td>Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic crRNA, unmodified (custom sequence)</td><td>Dharmacon</td><td>Custom0247</td><td></td></tr><tr><td>Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA</td><td>Dharmacon</td><td>U-002005-05</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant wild-type &lt;em&gt;Streptococcus&lt;/em&gt; &lt;em&gt;pyogenes&lt;/em&gt; Cas9-NLS purified protein, 40 &amp;micro;M</td><td>University of California-Berkeley QB3 Macrolab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Custom donor plasmid (PriorityGENE)</td><td>Genewiz</td><td></td><td>donor insert design was synthesized and cloned into pUC57 backbone by Genewiz</td></tr><tr><td>DNA LoBind Tube 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi EF</td><td>Clontech</td><td>740424.50</td><td></td></tr><tr><td>Neon Transfection System</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK5000</td><td></td></tr><tr><td>Neon Transfection System, 100 &amp;micro;L kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK10096</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Polystyrene Round-bottom Tube with Cell Strainer Cap</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>15 mL High Clarity Polyproylene Conical Tube</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>FACSAriaIII Fusion</td><td>BD Biosciences</td><td>656700</td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo version 10.2</td><td>TreeStar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NERL Blood Bank Saline</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8504</td><td>used as preservative-free FACS Buffer</td></tr><tr><td>Olympus SZX7 Stereo Microscope, or similar</td><td>Olympus, or similar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture plate, 96-well</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>96 well Cell Culture Plate, V-Bottom</td><td>CELLSTAR</td><td>351180</td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>Sigma</td><td>C2874-100ML</td><td>used as cryopreservation buffer for cells in 96-well plate format</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>24 well Cell Culture Plate</td><td>CELLSTAR</td><td>662160</td><td></td></tr></tbody></table>

endogenous protein tagging in human induced pluripotent stem cells using crispr/cas9

エクスプレス内因性タンパク質融合フレーム N 末端または C 末端蛍光タグひと誘導多能性幹細胞 (hiPSCs) を生成するためのプロトコルが表示されます。原核生物の CRISPR/Cas9 システム (クラスター化された定期的に空間短回文 CRISPR/繰り返し関連付けられている 9) は、大規模な外因性シーケンス相同監督修理 (HDR) でゲノムの遺伝子座に導入するに使えます。目的のノックアウトのために、このプロトコルはリボ核タンパク質 (RNP) を採用しています-ベースのアプローチを細胞への野生型化膿連鎖球菌Cas9 タンパク質、合成 2 一部ガイド RNA (gRNA) やドナー テンプレート プラスミドの配信先エレクトロポレーション。蛍光付けられた蛋白質を表現する推定編集されたセルは、蛍光性によって作動セル (FACS) の並べ替えで濃縮されています。系統が生成され、精密な編集の結果を分析することができます。興味の遺伝子の genomic 位置に蛍光タグを導入し、結果内局と融合タンパク質のダイナミクスを内因性規制、従来の過剰発現の重要な改善点に師事することができます。システム。遺伝子のタグ付けのためのモデル システムとして hiPSCs の使用は、二倍体、トランスのセルに付けられた蛋白質を調査する機会を提供します。HiPSCs は、複数の細胞のタイプに区別できます、のでこのアプローチを作成し、さまざまな同質細胞コンテキストの付けられた蛋白質を研究する機会を提供します。

この実験の目的は、LMNB1 遺伝子 (タンパク質の N 末端) の 5ʹ の終わりに mEGFP シーケンスを導入することにより核ヒトラミン B1 蛋白質 mEGFP (単量体強化された GFP) の融合をだった。リンカー (アミノ酸配列 SGLRSRAQAS) は、マイケル ・ デビッドソン蛍光タンパク質コレクション21から以前の cDNA の構造に基づいて選ばれました。潜在的な crRNA の認識とで胸の谷間を混乱させる可能にするので各候補者 crRNA のドナー テンプレート プラスミドの crRNA 結合領域は、mEGFP とリンカー順序のインシリコ挿入後中断された、点突然変異は必要ありません。ドナー シーケンス (図 1) の Cas9。ドナーの配列には、1 kb の相同性腕 mEGFP リンカー順序の両端の側面が含まれています。結果として得られる 2,734 シーケンスを確認、pUC57 バックボーンに複製された DNA の bp とエンドトキシン マキシ準備を使用して結果のドナー テンプレート プラスミドを精製しました。ドナー テンプレート プラスミッドおよび複雑な RNP 導入させた、推定編集した細胞を濃縮した、mEGFP 核ヒトラミン B1 融合タンパク質の局在を蛍光顕微鏡 (図 2) で確認しました。CrRNA1 トランスフェクションから結果だけは両方の crRNA シーケンス生産推定編集集団12ここでは、とおりです。
推定編集を表す 0.95 %megfp 陽性細胞が細胞に含まれている transfected LMNB1 crRNA1 gRNA、Cas9 蛋白質またはドナー テンプレート プラスミド エレクトロポレーション反応 (バッファーのみ) には含まれていない、負の制御と比較されたときmEGFP 核ヒトラミン B1 人口 (図 3 a)。この結果は、ノックイン効率以前に報告された12として、このメソッドを使用して多くのゲノム遺伝子座の間で観察の範囲内だった。
MEGFP 陽性細胞は、FACS により分離され、核封筒に mEGFP 核ヒトラミン B1 融合タンパク質の予想される局在を確認するライブ顕微鏡によるイメージングします。FACS 濃縮後細胞 LMNB1 crRNA1 の人口からの約 90% は mEGFP 陽性 (顕微鏡検査によって決定される) として示唆いくつかの mEGFP 陰性細胞は共同並べ替えプロシージャ中に GFP 陽性細胞の精製されました。これは、成功を編集するため、遺伝子選別できる 96 クローンのピッキングに使用できる濃縮の許容可能なレベルだった。一般的に、成功した濃縮のためのカットオフは 50 %gfp 陽性。
並べ替えられたセルの人口の大半は非分裂細胞の核膜 (核周辺) に蛍光を表示され、有糸分裂提供する自信を持って正しいゲノム中に細胞質内の拡張核ラミナを LMNB1 で編集軌跡。豊かな人口には、明るいまたは暗い信号を持つセルが含まれています。この信号強度の違いは正しいと不適切な結果とハイライトの系統が遺伝的検証をさらに生成するユーティリティ研究 (説明参照) の編集の組み合わせを反映可能性があります (図 3 b)12。系統発生後検証顕微鏡実験 (図 3 c) で均一の GFP 強度を示した細胞が遺伝子。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig1.jpg"> 図 1.LMNB1 遺伝子の N 末端 GFP タグの戦略を設計する。GFP タグ染色体 5 にある LMNB1 の最初のエクソンの N ターミナル挿入 5ʹ 設計されました。5ʹ と 3ʹ の両方の相同性の武器は 1 kb と開始コドン (ATG) と 2 番目のコドン (ホモロジー腕だけ部分的に図で表される) との間を満たす。2 候補者 crRNAs まだゲノム内で一意でありながら、可能な限り目的の挿入サイトに近い切断する Cas9 をご案内しています。MEGFP とアミノ酸リンカーのシーケンスは開始コドン (ノンスケール mEGFP とリンカー順序) の挿入だけ 3ʹ.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58130/58130fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig2.jpg"> 図 2.タグ付きの内生生産ワークフローによる系統。トランスフェクション コンポーネント、ホモロジー腕 (HAs、金で示されている) を含むドナー テンプレート プラスミド (金 crRNA と紫の tracrRNA と赤の Cas9 蛋白質を示す)、Cas9/crRNA/tracrRNA RNP 複合体を含むと FP リンカー順序 (で示されている緑) +electroporated。4 日後推定編集 FP 陽性細胞 FACS による濃縮 96 ウェル プレート (1,000 〜 細胞) の単一ウェルに、細胞のすべてを播くことによって集団として拡大し、労働人口数百万のまで文化の拡大細胞が「豊かな人口」として試金することができる (プロトコル手順 3.8 を参照してください).FP 陽性細胞の収量は、HDR12; 可変レートの変動により実験によって異なります成功した濃縮は通常 300 〜 5,000 を含めることができます約 1.6 × 10 のトランスフェクション後のセル6腰セル。予備のイメージング研究は、豊かな人口の融合蛋白質の局在と信号を確認しました。コロニーは拡大し凍結保存のための 96 ウェル プレートに手動で選ばれました。ゲノムの品質管理審査をさらに液滴デジタルを使用して PCR (ddPCR) および他の PCR に基づく試金を使用して前述の12として正しく編集したクローンを識別します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58130/58130fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig3.jpg"> 図 3.推定編集したセル人口の濃縮します。(A) 、LMNB1 の流れの cytometry プロット編集セル 4 日後トランスフェクションします。Y 軸は、GFP の強度を表示し、x 軸表示前方散乱。並べ替えのゲートは、バッファー制御に基づいて設定しました。HiPSCs は摂動に敏感なのでライブ/デッド汚れが省略され、非常に保守的な FSC/SSC ゲートが代わりに使用されました。(B)濃縮後、LMNB1 Cr1 の人口編集細胞核封筒 (予想 LMNB1 局在) にローカライズする GFP と細胞の ~ 90% を示した。人口は、いくつかの GFP 陰性細胞と同様、程度は GFP の細胞に含まれています。スケール バーは、10 ミクロンです。(C)系統世代後の細胞は、細胞周期依存の違いと、均一な GFP 強度を示した。スケール バーは、20 ミクロンです。

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Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

人間でタグ内因性のタンパク質誘導多能性幹細胞 CRISPR/Cas9 を使用して

タグ内因のプロトコル CRISPR/Cas9 を用いたひと誘導多能性幹細胞の蛍光札が付いている蛋白質の表現は、ここで説明。推定編集されたセル、蛍光活性化細胞選別濃縮し、クローン細胞を生成します。

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

endogenous-protein-tagging-human-induced-pluripotent-stem-cells-using

Research

JoVE Journal

Genetics

26.1K ビュー.  Allen Institute for Cell Science. タグ内因のプロトコル CRISPR/Cas9 を用いたひと誘導多能性幹細胞の蛍光札が付いている蛋白質の表現は、ここで説明。推定編集されたセル、蛍光活性化細胞選別濃縮し、クローン細胞を生成します。

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Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral vector mediated random integration. This protocol describes a universal and efficient transgene targeted addition platform in human iPSCs based on utilization of validated open-source TALENs and a gene-trap-like donor to deliver transgenes into a safe harbor locus. Importantly, effective gene editing is rate-limited by the delivery efficiency of gene editing vectors. Therefore, this protocol first focuses on preparation of iPSCs for transfection to achieve high nuclear delivery efficiency. When iPSCs are dissociated into single cells using a gentle-cell dissociation reagent and transfected using an optimized program, >50% cells can be induced to take up the large gene editing vectors. Because the AAVS1 locus is located in the intron of an active gene (PPP1R12C), a splicing acceptor (SA)-linked puromycin resistant gene (PAC) was used to select targeted iPSCs while excluding random integration-only and untransfected cells. This strategy greatly increases the chance of obtaining targeted clones, and can be used in other active gene targeting experiments as well. Two weeks after puromycin selection at the dose adjusted for the specific iPSC line, clones are ready to be picked by manual dissection of large, isolated colonies into smaller pieces that are transferred to fresh medium in a smaller well for further expansion and genetic and functional screening. One can follow this protocol to readily obtain multiple GFP reporter iPSC lines that are useful for in vivo and in vitro imaging and cell isolation.

TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.

トランスフェクション、選択、およびAAVS1セーフハーバーへのGFP遺伝子とTALENを標的とする人間の人工多能性幹細胞のコロニーピッキング

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral ...

発生生物学

Efficient Generation of hiPSC Neural Lineage Specific Knockin Reporters Using the CRISPR/Cas9 and Cas9 Double Nickase System

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human cells has been low, which prevents the generation of human cell lines at a desired rate. The past two years have witnessed a rapid progression on improving efficiency of genetic manipulation by genome editing tools such as the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) system. This manuscript describes a protocol for generating lineage specific human induced pluripotent stem cell (hiPSC) reporters using CRISPR/Cas system assisted homologous recombination. Procedures for obtaining necessary components for making neural lineage reporter lines using the CRISPR/Cas system, focusing on construction of targeting vectors and single guide RNAs, are described. This protocol can be extended to platform establishment and mutation correction in hiPSCs.

Genome editing tools such as the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) system have greatly improved gene targeting efficiency in human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). This manuscript describes a protocol for generating lineage specific hiPSC reporter using CRISPR/Cas system assisted homologous recombination.

hiPSC神経系統を効率的に生成するCRISPRを使用して特定のノック記者/ Cas9とCas9ダブルニッカーゼシステム

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human ...

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding human development and dissecting disease mechanisms in a dish. To capitalize on this potential application requires efficient genome-editing tools to generate hPSC mutants in disease-associated genes, as well as in vitro hPSC differentiation protocols to produce disease-relevant cell types that closely recapitulate their in vivo counterparts. An efficient genome-editing platform for hPSCs named iCRISPR has been developed through the TALEN-mediated targeting of a Cas9 expression cassette in the AAVS1 locus. Here, the protocols for the generation of inducible Cas9 hPSC lines using cells cultured in a chemically defined medium and a feeder-free condition are described. Detailed procedures for using the iCRISPR system for gene knockout or precise genetic alterations in hPSCs, either through non-homologous end joining (NHEJ) or via precise nucleotide alterations using a homology-directed repair (HDR) template, respectively, are included. These technical procedures include descriptions of the design, production, and transfection of CRISPR guide RNAs (gRNAs); the measurement of the CRISPR mutation rate by T7E1 or RFLP assays; and the establishment and validation of clonal mutant lines. Finally, we chronicle procedures for hPSC differentiation into glucose-responsive pancreatic &#946;-like cells by mimicking in vivo pancreatic embryonic development. Combining iCRISPR technology with directed hPSC differentiation enables the systematic examination of gene function to further our understanding of pancreatic development and diabetes disease mechanisms.

Protocols to generate hPSC mutant lines using the iCRISPR platform and to differentiate hPSCs into glucose-responsive &#946;-like cells are described. Combining genome editing technology with hPSC-directed differentiation provides a powerful platform for the systematic analysis of the role of lineage determinants in human development and disease progression.

ヒト膵臓の開発にリネージュの決定要因を問い合わせるためのゲノム編集とhPSCsの指向性分化

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

遺伝学

Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human development and investigate the pathophysiology of disease. By employing site-specific nucleases (SSNs) for genome editing, the rapid derivation of new hPSC lines harboring specific genetic alterations in an otherwise isogenic setting becomes possible. Zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs) and clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 are the most commonly used SSNs. All of these nucleases function by introducing a double stranded DNA break at a specified site, thereby promoting precise gene editing at a genomic locus. SSN-meditated genome editing exploits two of the cell&#39;s endogenous DNA repair mechanisms, non-homologous end joining (NHEJ) and homology directed repair (HDR), to either introduce insertion/deletion mutations or alter the genome using a homologous repair template at the site of the double stranded break. Electroporation of hPSCs is an efficient means of transfecting SSNs and repair templates that incorporate transgenes such as fluorescent reporters and antibiotic resistance cassettes. After electroporation, it is possible to isolate only those hPSCs that incorporated the repair construct by selecting for antibiotic resistance. Mechanically separating hPSC colonies and confirming proper integration at the target site through genotyping allows for the isolation of correctly targeted and genetically homogeneous cell lines. The validity of this protocol is demonstrated here by using all three SSN platforms to incorporate EGFP and a puromycin resistance construct into the AAVS1 safe harbor locus in human pluripotent&#160;stem cells.

Genome editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) can be done quickly and efficiently. Presented here is a robust experimental procedure to genetically engineer hPSCs as exemplified by editing the AAVS1 safe harbor locus to express EGFP and introduce antibiotic resistance.

ゲノム編集したヒト多能性幹細胞株の樹立：分離へのターゲティングから

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise heterozygous genetic modifications is challenging due to CRISPR-CAS9 mediated indel formation in the second allele. Here, we demonstrate a protocol to help overcome this difficulty by using two repair templates in which only one expresses the desired sequence change, while both templates contain silent mutations to prevent re-cutting and indel formation. This methodology is most advantageous for gene editing coding regions of DNA to generate isogenic control and mutant human stem cell lines for studying human disease and biology. In addition, optimization of transfection and screening methodologies have been performed to reduce labor and cost of a gene editing experiment. Overall, this protocol is widely applicable to many genome editing projects utilizing the human pluripotent stem cell model.

This protocol provides a method to facilitate the generation of defined heterozygous or homozygous nucleotide changes using CRISPR-CAS9 in human pluripotent stem cells.

ヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-CAS9を用いて定義されたゲノム修飾の生成

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing in mammalian cells. Here we describe detailed procedures to seamlessly genome edit the hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4&#945;) locus as an example in human pluripotent stem cells. Combining a piggyBac-based donor plasmid and the CRISPR-Cas9 nickase mutant in a two-step genetic selection, we demonstrate correct and efficient targeting of the HNF4&#945; locus.

Here, we describe a detailed method for seamless gene editing in human pluripotent stem cells using a piggyBac-based donor plasmid and the Cas9 nickase mutant. Two point mutations were introduced into exon 8 of the hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4&#945;) locus in human embryonic stem cells (hESCs).

シームレスなゲノム編集によるヒト多能性幹細胞への点突然変異の導入

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...

CRISPR/Cas9 Technology in Restoring Dystrophin Expression in iPSC-Derived Muscle Progenitors

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe progressive muscle disease caused by mutations in the dystrophin gene, which ultimately leads to the exhaustion of muscle progenitor cells. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9 (CRISPR/Cas9) gene editing has the potential to restore the expression of the dystrophin gene. Autologous induced pluripotent stem cells (iPSCs)-derived muscle progenitor cells (MPC) can replenish the stem/progenitor cell pool, repair damage, and prevent further complications in DMD without causing an immune response. In this study, we introduce a combination of CRISPR/Cas9 and non-integrated iPSC technologies to obtain muscle progenitors with recovered dystrophin protein expression. Briefly, we use a non-integrating Sendai vector to establish an iPSC line from dermal fibroblasts of Dmdmdx mice. We then use the CRISPR/Cas9 deletion strategy to restore dystrophin expression through a non-homologous end joining of the reframed dystrophin gene. After PCR validation of exon23 depletion in three colonies from 94 picked iPSC colonies, we differentiate iPSC into MPC by doxycycline (Dox)-induced expression of MyoD, a key transcription factor playing a significant role in regulating muscle differentiation. Our results show the feasibility of using CRISPR/Cas9 deletion strategy to restore dystrophin expression in iPSC-derived MPC, which has significant potential for developing future therapies for the treatment of DMD.

Here, we present a Cas9-based exon23 deletion protocol to restore dystrophin expression in iPSC from Dmdmdx mouse-derived skin fibroblasts and directly differentiate iPSCs into myogenic progenitor cells (MPC) using the Tet-on MyoD activation system.

iPSC由来筋前駆体におけるジストロフィン発現の回復に関するCRISPR/Cas9技術

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe progressive muscle disease caused by mutations in the dystrophin gene, which ultimately leads to the ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted for research in regenerative medicine and are currently in clinical trials for eye diseases, diabetes, heart diseases, and other disorders. The potential to differentiate into specialized cell types coupled with the recent advances in genome editing technologies including the CRISPR/Cas system have provided additional opportunities for tailoring the genome of iPSC for varied applications including disease modeling, gene therapy, and biasing pathways of differentiation, to name a few. Among the available editing technologies, the CRISPR/Cas9 from Streptococcus pyogenes has emerged as a tool of choice for site-specific editing of the eukaryotic genome. The CRISPRs are easily accessible, inexpensive, and highly efficient in engineering targeted edits. The system requires a Cas9 nuclease and a guide sequence (20-mer) specific to the genomic target abutting a 3-nucleotide &#34;NGG&#34; protospacer-adjacent-motif (PAM) for targeting Cas9 to the desired genomic locus, alongside a universal Cas9 binding tracer RNA (together called single guide RNA or sgRNA). Here we present a step-by-step protocol for efficient generation of feeder-independent and footprint-free iPSC and describe methodologies for genome editing of iPSC using the Cas9 ribonucleoprotein (RNP) complexes. The genome editing protocol is effective and can be easily multiplexed by pre-complexing sgRNAs for more than one target with the Cas9 protein and simultaneously delivering into the cells. Finally, we describe a simplified approach for identification and characterization of iPSCs with desired edits. Taken together, the outlined strategies are expected to streamline generation and editing of iPSC for manifold applications.

This protocol describes in detail the generation of footprint-free induced pluripotent stem cells (iPSCs) from human pancreatic cells in feeder-free conditions, followed by editing using CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins and characterization of the modified single-cell clones.

効率的な生成および CRISPR Cas9 システムを用いた人間の膵臓細胞から Ips をフィーダー フリーの編集

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

生物工学

Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to proteins of interest. Identification of gene functions in cell line models is important for gene discovery and exploration of cell-intrinsic mechanisms. However, genetic manipulations of immune cells such as T cells and macrophage cell lines using CRISPR/Cas9-mediated knock-in are difficult because of the low transfection efficiency of these cells, especially in a quiescent state. To modify genes in immune cells, drug-resistance selection and viral vectors are typically used to enrich for cells expressing the CRIPSR/Cas9 system, which inevitably results in undesirable intervention of the cells. In a previous study, we designed dual fluorescent reporters coupled to CRISPR/Cas9 that were transiently expressed after electroporation. This technical solution leads to rapid gene deletion in immune cells; however, gene knock-in in immune cells such as T cells and macrophages without the use of drug-resistance selection or viral vectors is even more challenging. In this article, we show that by using cell sorting to aid selection of cells transiently expressing CRISPR/Cas9 constructs targeting the Rosa26 locus in combination with a donor plasmid, gene knock-in can be achieved in both T cells and macrophages without drug-resistance enrichment. As an example, we show how to express human ACE2, a receptor of SARS-Cov-2, which is responsible for the current Covid-19 pandemic, in RAW264.7 macrophages by performing knock-in experiments. Such gene knock-in cells can be widely used for mechanistic studies.

This protocol uses fluorescent reporters and cell sorting to simplify knock-in experiments in macrophage and T cell lines. Two plasmids are used for these simplified knock-in experiments, namely a CRISPR/Cas9- and DsRed2-expressing plasmid and a homologous recombination donor plasmid expressing EBFP2, which is permanently integrated at the Rosa26 locus in immune cells.

CRISPR/Cas9による遺伝子ノックインとマクロファージおよびT細胞株における細胞分類

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to ...

免疫・感染学

One-step CRISPR-based Strategy for Endogenous Gene Tagging in Drosophila melanogaster

The study of protein subcellular localization, dynamics, and regulation in live cells has been profoundly transformed by the advent of techniques that allow the tagging of endogenous genes to produce fluorescent fusion proteins. These methods enable researchers to visualize protein behavior in real time, providing valuable insights into their functions and interactions within the cellular environment. Many current gene tagging studies employ a two-step process where visible markers, such as eye color changes, are used to identify genetically modified organisms in the first step, and the visible marker is excised in the second step. Here, we present a one-step protocol to perform precise and rapid endogenous gene tagging in Drosophila melanogaster, which enables screening for engineered lines without the visible eye marker, offering a significant advantage over past methods. To screen for successful gene-tagging events, we employ a PCR-based technique to genotype individual flies by analyzing a small segment from their middle leg. Flies that pass the screening criteria are then used to produce stable stocks. Here, we detail the design and construction of CRISPR editing plasmids and methods for screening and confirmation of engineered lines. Together, this protocol improves the efficiency of endogenous gene tagging in Drosophila significantly and enables studies of cellular processes in vivo.

One-step CRISPR-based Strategy for Endogenous Gene Tagging in Drosophila melanogaster

Here, we present a simplified endogenous gene tagging protocol for Drosophila, which utilizes a PCR-based technique for marker-free identification of successful genetic modifications, facilitating the development of stable knock-in lines.

ショウジョウバエのメラノガスターにおける内在性遺伝子タグ付けのためのワンステップCRISPRベースの戦略

The study of protein subcellular localization, dynamics, and regulation in live cells has been profoundly transformed by the advent of techniques that ...

人間でタグ内因性のタンパク質誘導多能性幹細胞 CRISPR/Cas9 を使用して

要約

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トランスフェクション、選択、およびAAVS1セーフハーバーへのGFP遺伝子とTALENを標的とする人間の人工多能性幹細胞のコロニーピッキング

hiPSC神経系統を効率的に生成するCRISPRを使用して特定のノック記者/ Cas9とCas9ダブルニッカーゼシステム

ヒト膵臓の開発にリネージュの決定要因を問い合わせるためのゲノム編集とhPSCsの指向性分化

ゲノム編集したヒト多能性幹細胞株の樹立：分離へのターゲティングから

ヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-CAS9を用いて定義されたゲノム修飾の生成

シームレスなゲノム編集によるヒト多能性幹細胞への点突然変異の導入

iPSC由来筋前駆体におけるジストロフィン発現の回復に関するCRISPR/Cas9技術

効率的な生成および CRISPR Cas9 システムを用いた人間の膵臓細胞から Ips をフィーダーフリーの編集

CRISPR/Cas9による遺伝子ノックインとマクロファージおよびT細胞株における細胞分類

ショウジョウバエのメラノガスターにおける内在性遺伝子タグ付けのためのワンステップCRISPRベースの戦略

人間でタグ内因性のタンパク質誘導多能性幹細胞 CRISPR/Cas9 を使用して

要約

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トランスフェクション、選択、およびAAVS1セーフハーバーへのGFP遺伝子とTALENを標的とする人間の人工多能性幹細胞のコロニーピッキング

hiPSC神経系統を効率的に生成するCRISPRを使用して特定のノック記者/ Cas9とCas9ダブルニッカーゼシステム

ヒト膵臓の開発にリネージュの決定要因を問い合わせるためのゲノム編集とhPSCsの指向性分化

ゲノム編集したヒト多能性幹細胞株の樹立：分離へのターゲティングから

ヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-CAS9を用いて定義されたゲノム修飾の生成

シームレスなゲノム編集によるヒト多能性幹細胞への点突然変異の導入

iPSC由来筋前駆体におけるジストロフィン発現の回復に関するCRISPR/Cas9技術

効率的な生成および CRISPR Cas9 システムを用いた人間の膵臓細胞から Ips をフィーダー フリーの編集

CRISPR/Cas9による遺伝子ノックインとマクロファージおよびT細胞株における細胞分類

ショウジョウバエのメラノガスターにおける内在性遺伝子タグ付けのためのワンステップCRISPRベースの戦略

効率的な生成および CRISPR Cas9 システムを用いた人間の膵臓細胞から Ips をフィーダーフリーの編集