ダフネ Dambournet は、多くの洞察力に富んだ議論や編集、イラスト、原稿の批判的読解のアンジェ リーク ・ ネルソン、アンドリュー タッカー ラミン B1 セルのタグ付きの mEGFP ラインを生成するためのタオは遺伝子についてのアドバイスを感謝いたします。遺伝子の編集および品質管理プロセスへの貢献のため細胞科学の幹細胞と遺伝子編集とアレンの協会のアッセイ開発チームを確認したいです。私たちの細胞の遺伝子編集行を作成するために使用私たち WTC ラインは、グラッドス トーン研究所、UCSF でブルース ・ r ・ コンクリン研究所によって提供されました。我々 は細胞科学創設者、ポール g. アレン、励まし、彼のビジョンのためのアレンの協会に感謝し、サポートします。

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HiPSCs の蛍光タンパク質融合を規制内生を生成するため、ここで示す方法は、ライブセル イメージングから様々 な機能の研究に至るまでのアプリケーションと編集遺伝子細胞を生成するための汎用性と強力なアプローチと」患者由来による行13,14,15を使用して皿に病」モデル。それが潜在的モデルや正しい病気の原因となる変異22,23に他のタグまたは小さい遺伝の変更を導入して使用する中に、N または C-末端内因性のタンパク質の大きな FP タグを導入するこのメソッドを使用すると、.小さい挿入相同性の腕のサイズになることがありますが、このメソッドで提示を編集する一般的なアプローチは、24,25をかかることがあります。HiPSCs の使用が彼らの広大なユーティリティは、慎重に最適化と強くお勧めこのプロトコルは他の哺乳類セルラインのゲノムを編集するのには適応があります。
(マイクロ アレイまたは RNA シーケンス データ) から推定するトラン スクリプト豊富な FP がタグ付けに興味の遺伝子を識別するとき良いトラン スクリプトのレベルは常に相関がないが、遺伝子または関心のアイソ フォームを表明したかどうかを評価するためのポイントを始めています。蛋白質レベル。ここで説明されている FACS 濃縮方法が興味のセル型で少なくとも適度に表現される遺伝子の最高を仕事します。この戦略はまた、バック グラウンド強度比への信号が非常に低い12,19centrin、desmoplakin、paxillin など点状および/または離散の局在パターンを示す融合の選択で成功しています。遺伝子が高発現していないまたは派生セル型でしか表現が追加選定を必要があります。
ひと培養細胞で使用されるテンプレート プラスミド crRNA とドナーのデザインの出発点は、人間の参照ゲノム (GRCh38) をする必要があります。異なる培養細胞のゲノムは、同じ種の内で変わることができるので CRISPR/Cas9 はシーケンス固有セル行固有亜種 (一塩基多型または挿入/削除 (オクターリピート)) を識別するために非常に便利ですので参照ゲノムとは異なる、デザインにこれらを組み込みます。これにより crRNAs がホストのゲノムに互換性があること、ドナー テンプレート プラスミド ホモロジー腕が任意のセル行の特定のバリアントが保持されます。推奨される戦略は、設計プロセス中に crRNAs とドナーのテンプレート プラスミド ホモロジー腕にホモの亜種を組み込むことです。ヘテロ接合体の変形を組み込むことはオプションです。大きなノックアウトの実験のため特定の試薬を使用し、このプロトコルの他主な考慮事項を以下に。
Cas9 タンパク質
Cas9 蛋白質を使用しての主な利点は、Cas9 を導入して、RNP 複合として gRNA は、Cas9 と gRNA の発現が数日間続く可能性があり、つながるプラスミド ベースのアプローチと比較してのヌクレアーゼ活性の限られた期間での結果に示されています。大きいとオフ-対象活動26,27。Cas9 蛋白質を使用しての追加の利点は、劈開は一度細胞の中にすぐに利用できることです。これより従来の Cas9 mRNA または Cas9/gRNA プラスミドを使用して転写、翻訳、タンパク質のプロセッシング26,28を必要とするとは対照的します。野生型ピオゲネス s. Cas9 蛋白質が多く商業ソースから可能です。
ガイド RNA
目的の FP 挿入部位付近の crRNA ターゲットがターゲットを持つゼロまたは数予測をオフ - ホストのゲノム29,30,31,32を見つけるための多くの公開ツールがあります。HDR と HDR 結果の精度の効率は、crRNA ターゲット特定の軌跡12で使用によって大きく異なります。このため、いくつかの crRNAs をテスト (2-4、できれば 50 以内に目的の挿入部位の bp) 軌跡あたりは、これは編集の実験が成功の確率を高める可能性がありますので勧め。GRNA を提供するための現在の可能性を含める合成 2 部 crRNA と tracrRNA、合成単一 gRNAs (sgRNAs)の in vitro転写 sgRNAs、または U6 プロモーターから sgRNA を発現する細胞にプラスミドを提供します。このプロトコルは高い切断活性の最適化されていません。そのまま 2 部の crRNA と tracrRNA (材料表参照) は、セルに少なくとも潜在的な摂動を起こしながらモノラル対立 FP タグ セルラインを生成することを目標に使用されました。
ドナー テンプレート プラスミド
相同性のいくつか腕シーケンスを提供ドナー テンプレート プラスミドが HDR イベント中に宿主ゲノムに組み込まれます、ため crRNA 認識部位に点突然変異を導入次の HDR Cas9 で胸の谷間をさらに防ぐためするべき。通常最も簡単な分裂的な変更は PAM シーケンスを変異です。いくつかの非正規の PAM のシーケンスは、野生型ピオゲネス s. Cas9 でまだ認識できる、ために、NGG、NAG、NGA の33を使用しないようにすることをお勧めします。相同性腕を変異、非同義変異とまれなコドンの導入を避けます。PAM シーケンスに同義的な変化は不可能、種地域で 3 つの同義の点突然変異をすることを検討 (10 bp PAM に近位) crRNA 結合部位の。これらの地域は重要な規制シーケンスを含めることができますので、5ʹ 非翻訳領域 (UTR) でこれらの変更を行うときに十分な注意が必要があります。コンサルティングの遺伝的保全データベース UCSC のゲノムのブラウザー比較ゲノミクスのトラックは、これらのケースでのガイダンスを提供できるよう非常に節約された拠点17への変更よりも、非保存の拠点への変更より良い容認されるかもしれない。FP シーケンスの単なる挿入がある (図 1) のように crRNA 結合部位を破壊する十分なただし、新しく追加されたシーケンスは crRNA バインディングおよび PAM シーケンスの永続化のためにチェックしなければなりません。
FP とネイティブ蛋白質のアミノ酸のリンカーが融合蛋白質34の機能を節約するためにお勧めします。多くの場合特定料金のサイズ アミノ酸リンカーを選択可能性があります。場合は内因性にターゲットを絞ったようなデザイン cDNA 融合融合タンパク質よく研究されている、CRISPR/Cas9 ノックアウトの実験12,19同じリンカー シーケンスが使えます。このような情報を使用できない場合は、GTSGGS などの短いリンカーもされて正常に12を使用します。他の研究は、さまざまなターゲット35の汎用小型 3-アミノ酸リンカー順序との成功を実証しています。
トランスフェクションと FACS 濃縮
多くの市販のトランスフェクション試薬は、エレクトロポレーション システムを使用するサイズ、料金、および構成の広い範囲で試薬を提供することができますに対し分子の特定の種類の細胞への配信のため処方されています。HiPSCs ようにセルに transfect ハードの一般的なトランスフェクション法に加えて、エレクトロポレーションはまたこのメソッドで説明されているように CRISPR/Cas9 を介した FP ノックのすべての 3 つのコンポーネントを提供することの利点を運ぶ。トレーシー ・ メソッド (データは示されていない)、また RNP 配信26,28,36 の他のユーザーによって使用されていますと、他の市販試薬と比較して最高の結果を生成するエレクトロポレーションが見つかりました.
HiPSCs を編集するため、このプロトコルを使用する場合、特別な注意は編集プロセスの最適な細胞生存率と最小限の分化遺伝子の前後にセルの穏やかな取扱いの確保にすべき。特に、FACS 濃縮方法が最大ノズル可能 (130 μ m)、低流量 (24 μ L/分)、防腐剤フリー シース液を用いて幹細胞を並べ替えに適応する必要があります (生理食塩水など材料の表を参照)、および低いサンプル圧力 (10 psi)。幹細胞の最適生存率の結果、並べ替え、単一のセルではなく FACS 濃縮 hiPSCs が一括で並べ替えられ、細胞の生存率と幹細胞の整合性を最適化する人口として展開します。ただし、単一セルの並べ替えが以下の敏感な細胞のタイプの適切なあります。細胞の生存を促進するため、細胞は FACS 濃縮のため収穫後 1 時間よりは、もはや文化に戻り、並べ替えプロセス全体を通じて室温で保管します。いくつかの細胞の種類、細胞の生存は並べ替えプロセスを通して氷 (4 ° C) の上のインキュベーターの細胞によって強化があります。
FP 陽性細胞の一括拡大は、系統を生成する前に融合蛋白質のローカリゼーションのための画像解析による人口を評価する機会を提供します。セルの結果豊かな人口は、いくつかの研究のために十分かもしれないが、これらの集団はよく FP 様々 な強度の信号を表示します。分離系統機能実験12のより適切な意思統一信号 (図 3) があります。
クローンの細胞ラインの生成
編集とクローン線の生成処理中、細胞の形態を監視することが重要です。フィーダー無料条件で栽培による植民地は、滑らかなエッジとも、十分に詰めてセンター12,18,19を表わすべきであります。分化した細胞は、文化の 5% 未満で観察すべき。個々 のコロニーを選ぶとき、それらにその展示形態を選択します。イベントを継 96 ウェル プレート、中に形態のためのクローンをチェックし、これが差別化につながるや遺伝的不安定性の徴候である可能性がありますが大きくなり過ぎたものを中止します。
クローンの細胞ラインの生成できる遺伝確認正確な編集のため Cas9 誘起二重鎖切断がゲノムのために重要なある頻繁に修復される不正確定款目的の軌跡でタグにもかかわらず。前述の PCR アッセイことを示した累積 10 ユニークなゲノム遺伝子座の間で多く (45%) FP 発現クローンのゲノム12ドナー プラスミド バックボーン統合対象の座または (稀に) ランダムに苦しみました。また、GFP 陽性の 23% のクローンを作成 (n = 177) 10 ユニークな遺伝子座の間で、またはタグなしの対立遺伝子、NHEJ12可能性があります予想される crRNA 切削現場近くの突然変異を隠すことがわかった。多くの系統 (~ 100 クローン/編集) のこの遺伝子解析 FP 式と単独で予想される融合蛋白質のローカリゼーションは正確な編集12 には保証しないので、細胞集団では不可能です遺伝検証の重要性を強調しました。.さらに、これらの PCR に基づく試金は、有意義な分析が完了する前に系統発生の必要性を正当化、確実に細胞の豊かな人口に実行できません。挿入された FP タグの遺伝学的確認と (モノラル対立編集したクローン) で未編集の対立遺伝子の遺伝的整合性の検証は、タグ式を超えてターゲットの軌跡で正確な編集を確認する必要です。
Bi 対立編集率が低いと (サンガーとエキソーム配列によって試金) としてターゲットを突然変異の欠如は、この方法で (未発表データ)12を使用して、日付に観察されています。これは、CRISPR/Cas9 実験26,27短期持続 RNP の使用を記述する先行研究と一致。Bi 対立編集クローン細胞の欠如特定の軌跡がありますまたはセルの 2 つを容認することができないのためと推定される bi 対立編集されたセルがあった以前に公開された実験の重要な蛋白質のコピー タグ別 (TUBA1B)12が、一つの座 (LMNB1) の観察。Bi 対立の完全に検証されたクローン細胞株は、mEGFP19このメソッド タグ ST6 β-ガラクトシド α 2, 6 シアル酸転移酵素 1 (ST6GAL1) および RAB5A メンバー RAS 癌遺伝子家族 (RAB5A) を使用して生成されています。
ゲノムの編集の精度を確認し、超えてさらにクローン線を特徴付けるし、満たすすべての幹細胞、ゲノム、クローンの識別に使用することができます品質管理試金の様々 ながあるし、細胞生物学的基準は研究を将来的に使用.細胞生物学・機能の試金を使用して、適切な表現、ローカリゼーション、および融合タンパク質12の機能を確認できます。未編集のペアレンタル コントロールに比較は、編集プロセスのローカリゼーション ・動態・機能に及ぼす影響の評価に役立ちます。他のアッセイなど成長解析とゲノム安定性をテストすることができますは、タグ付きタンパク質がセルに摂動かどうか。使用すると、このプロトコルでは、多能性マーカーと微分の潜在性の評価が下流の貴重なクローン研究12を決定する際に重要なことができます。文化を拡張したため、遺伝的不安定性、成長率を監視していくことが示されているし、クローン細胞の染色体はまた重要な12,37。ただし、最終的なもの編集されたセルの使用レベルと幅広い品質管理分析が最終的に決定して、アプリケーションによって異なります。

ゲノム編集戦略、細胞プロセスを研究に CRISPR/Cas9 特にの使用になってますますアクセスし貴重な1,2,3,4,5,6,7. CRISPR/Cas9 の多くのアプリケーションの一つは、遺伝子やタンパク質製品8 の活動のためのレポーターとして特定のゲノム遺伝子座に GFP など大規模な外因性シーケンスの (監督ホモロジー修理 (HDR)) で導入.この手法を使用して、内局と5 興味の蛋白質のダイナミクスを可視化する結果の内生的規制の融合蛋白質を使用できます。、内因性の開いたリーディング ・ フレームに蛍光タンパク質シーケンスに参加できます。 ,6,9,10,11。タグ内因蛋白質過剰発現システムに比べて多くの利点を提供して、人間のゲノムの大規模なシーケンスの挿入は通常選択範囲または濃縮可能なセルの人口を得るために戦略を求めて非効率的なプロセス簡単に学ぶ5,12であります。
このプロトコルでは、目的の genomic 位置に蛍光タンパク質 (FP) をエンコードの DNA シーケンスの挿入について説明します。プロトコルには、デザインとドナー テンプレート プラスミッドおよび複雑なリボ核タンパク質 (RNP) の配信 (野生型ピオゲネス s. Cas9 タンパク質合成の CRISPR RNA (crRNA) とトランス活性化 crRNA (tracrRNA)) が含まれています。述べる推定編集した細胞蛍光性によって作動セル (FACS) を並べ替えおよび細胞ラインの生成プロセスの充実です。日には、このメソッドは、エピジェネティックまたは (稀に) bi 対立緑色蛍光タンパク質 (GFP) タグ分類主要な細胞構造を表す 20 5 蛋白質によるラインを生成する使用されています。これらの努力からの結果の編集されたセルは、予想される遺伝的挿入、正しくローカライズの融合蛋白質を表現、多能性と安定した染色体12 (と未発表のデータ) を維持確認されています。このメソッドは、他の複数の生成にも使用されていますシングルとデュアル (同じセルにタグ付きの 2 つの異なる蛋白質) 編集 hiPSCs (未発表データ) の集団。
多くの従来の細胞とは異なり彼ら、二倍体、karyotypically ので安定性非変形、増殖性健康なドナー由来ヒト Ips はこれらのゲノム編集の努力のため選ばれました。これらのプロパティは、基本の細胞生物学と疾患モデリングを勉強するため魅力的なモデルを提供します。なお、hiPSCs の微分の潜在性は様々 な系統、同質細胞オルガノイド、組織「皿に病気」モデル13 などを用いたセル型並列で複数の発達段階を研究する機会を提供します ,14,15。このプロトコルは hiPSCs (WTC 線) の開発は、他の哺乳類セルラインを使用してプロトコルの開発のために有益かもしれません。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1169px;" width="1169">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Geneious R9</td>
			<td style="width:231px;">Biomatters, or similar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:515px;">bioinformatics software for in silico donor plasmid design</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">TE Buffer pH 8.0</td>
			<td style="width:231px;">IDT, or similar</td>
			<td style="width:119px;">11-01-02-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:305px;">HERAcell VIOS 160i CO2 incubator, or similar</td>
			<td style="width:231px;">ThermoFisher Scientific, or similar</td>
			<td style="width:119px;">51030408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">Pipettes (1000 &#181;L, 200 &#181;L, 20 &#181;L, 10 &#181;L, 2 &#181;L)</td>
			<td style="width:231px;">Rainin, or similar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Pipette tips (1000 &#181;L, 200 &#181;L, 20 &#181;L)</td>
			<td style="width:231px;">Rainin, or similar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Multi-channel Pipette (200 &#181;L)</td>
			<td style="width:231px;">Rainin, or similar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Serological pipetes (25 mL, 10 mL, 5 mL)</td>
			<td style="width:231px;">Costar, or similar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">BRAND 8-Channel Manifold for Quiksip, Autoclavable</td>
			<td style="width:231px;">Millipore Sigma, or similar</td>
			<td style="width:119px;">BR704526-1EA</td>
			<td style="width:515px;">use with non-filtered pipet tips, such as Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10, below</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10</td>
			<td style="width:231px;">Thermo Fisher, or similar</td>
			<td style="width:119px;">3501-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">XP2 Pipette Controller</td>
			<td style="width:231px;">Drummond, or similar</td>
			<td style="width:119px;">4-000-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Disposable Pasteur Pipets</td>
			<td style="width:231px;">VWR, or similar</td>
			<td style="width:119px;">53300-567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet</td>
			<td style="width:231px;">CELLGARD, or similar</td>
			<td style="width:119px;">NU-481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced</td>
			<td style="width:231px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">354230</td>
			<td style="width:515px;">lot tested before use with hiPSC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">DMEM/F12 (-phenol red)</td>
			<td style="width:231px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11039-021</td>
			<td>cold, for diluting Matrigel 1:30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">mTeSR1 Complete Media</td>
			<td style="width:231px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:119px;">85850</td>
			<td>recommended growth media for WTC hiPSC line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:231px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">WTC hiPSC line</td>
			<td style="width:231px;">Coriell</td>
			<td style="width:119px;">GM25256</td>
			<td>the hiPSC line used in this protocol is available through Coriell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Tissue culture dish 100 mm</td>
			<td style="width:231px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">6-well Cell Culture Plate</td>
			<td style="width:231px;">CELLSTAR</td>
			<td style="width:119px;">657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">StemPro Accutase</td>
			<td style="width:231px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">A11105-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS) no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:231px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">15 mL polystyrene conical</td>
			<td style="width:231px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">62.554.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Y-27632 (ROCK Inhibitor)</td>
			<td style="width:231px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:119px;">72308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic crRNA, unmodified (custom sequence)</td>
			<td style="width:231px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">Custom0247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA</td>
			<td style="width:231px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">U-002005-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">Recombinant wild-type Streptococcus pyogenes Cas9-NLS purified protein, 40 &#181;M</td>
			<td style="width:231px;">University of California-Berkeley QB3 Macrolab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">Custom donor plasmid (PriorityGENE)</td>
			<td style="width:231px;">Genewiz</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:515px;">donor insert design was synthesized and cloned into pUC57 backbone by Genewiz</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">DNA LoBind Tube 1.5 mL</td>
			<td style="width:231px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">NucleoBond Xtra Maxi EF</td>
			<td style="width:231px;">Clontech</td>
			<td style="width:119px;">740424.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Neon Transfetion System</td>
			<td style="width:231px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MPK5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Neon Transfection System, 100 &#181;L kit</td>
			<td style="width:231px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MPK10096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">5 mL Polystyrene Round-bottom Tube with Cell Strainer Cap</td>
			<td style="width:231px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">15 mL High Clarity Polyproylene Conical Tube</td>
			<td style="width:231px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">FACSAriaIII Fusion</td>
			<td style="width:231px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">656700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">FACSDiva software</td>
			<td style="width:231px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">FlowJo version 10.2</td>
			<td style="width:231px;">TreeStar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">NERL Blood Bank Saline</td>
			<td style="width:231px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">8504</td>
			<td>used as preservative-free FACS Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Olympus SZX7 Stereo Microscope, or similar</td>
			<td style="width:231px;">Olympus, or similar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Tissue culture plate, 96-well</td>
			<td style="width:231px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">96 well Cell Culture Plate, V-Bottom</td>
			<td style="width:231px;">CELLSTAR</td>
			<td style="width:119px;">351180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">CryoStor CS10</td>
			<td style="width:231px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C2874-100ML</td>
			<td>used as cryopreservation buffer for cells in 96-well plate format</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Parafilm</td>
			<td style="width:231px;">Bemis</td>
			<td style="width:119px;">PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">24 well Cell Culture Plate</td>
			<td style="width:231px;">CELLSTAR</td>
			<td style="width:119px;">662160</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

endogenous protein tagging in human induced pluripotent stem cells using crispr/cas9

エクスプレス内因性タンパク質融合フレーム N 末端または C 末端蛍光タグひと誘導多能性幹細胞 (hiPSCs) を生成するためのプロトコルが表示されます。原核生物の CRISPR/Cas9 システム (クラスター化された定期的に空間短回文 CRISPR/繰り返し関連付けられている 9) は、大規模な外因性シーケンス相同監督修理 (HDR) でゲノムの遺伝子座に導入するに使えます。目的のノックアウトのために、このプロトコルはリボ核タンパク質 (RNP) を採用しています-ベースのアプローチを細胞への野生型化膿連鎖球菌Cas9 タンパク質、合成 2 一部ガイド RNA (gRNA) やドナー テンプレート プラスミドの配信先エレクトロポレーション。蛍光付けられた蛋白質を表現する推定編集されたセルは、蛍光性によって作動セル (FACS) の並べ替えで濃縮されています。系統が生成され、精密な編集の結果を分析することができます。興味の遺伝子の genomic 位置に蛍光タグを導入し、結果内局と融合タンパク質のダイナミクスを内因性規制、従来の過剰発現の重要な改善点に師事することができます。システム。遺伝子のタグ付けのためのモデル システムとして hiPSCs の使用は、二倍体、トランスのセルに付けられた蛋白質を調査する機会を提供します。HiPSCs は、複数の細胞のタイプに区別できます、のでこのアプローチを作成し、さまざまな同質細胞コンテキストの付けられた蛋白質を研究する機会を提供します。

この実験の目的は、LMNB1 遺伝子 (タンパク質の N 末端) の 5ʹ の終わりに mEGFP シーケンスを導入することにより核ヒトラミン B1 蛋白質 mEGFP (単量体強化された GFP) の融合をだった。リンカー (アミノ酸配列 SGLRSRAQAS) は、マイケル ・ デビッドソン蛍光タンパク質コレクション21から以前の cDNA の構造に基づいて選ばれました。潜在的な crRNA の認識とで胸の谷間を混乱させる可能にするので各候補者 crRNA のドナー テンプレート プラスミドの crRNA 結合領域は、mEGFP とリンカー順序のインシリコ挿入後中断された、点突然変異は必要ありません。ドナー シーケンス (図 1) の Cas9。ドナーの配列には、1 kb の相同性腕 mEGFP リンカー順序の両端の側面が含まれています。結果として得られる 2,734 シーケンスを確認、pUC57 バックボーンに複製された DNA の bp とエンドトキシン マキシ準備を使用して結果のドナー テンプレート プラスミドを精製しました。ドナー テンプレート プラスミッドおよび複雑な RNP 導入させた、推定編集した細胞を濃縮した、mEGFP 核ヒトラミン B1 融合タンパク質の局在を蛍光顕微鏡 (図 2) で確認しました。CrRNA1 トランスフェクションから結果だけは両方の crRNA シーケンス生産推定編集集団12ここでは、とおりです。
推定編集を表す 0.95 %megfp 陽性細胞が細胞に含まれている transfected LMNB1 crRNA1 gRNA、Cas9 蛋白質またはドナー テンプレート プラスミド エレクトロポレーション反応 (バッファーのみ) には含まれていない、負の制御と比較されたときmEGFP 核ヒトラミン B1 人口 (図 3 a)。この結果は、ノックイン効率以前に報告された12として、このメソッドを使用して多くのゲノム遺伝子座の間で観察の範囲内だった。
MEGFP 陽性細胞は、FACS により分離され、核封筒に mEGFP 核ヒトラミン B1 融合タンパク質の予想される局在を確認するライブ顕微鏡によるイメージングします。FACS 濃縮後細胞 LMNB1 crRNA1 の人口からの約 90% は mEGFP 陽性 (顕微鏡検査によって決定される) として示唆いくつかの mEGFP 陰性細胞は共同並べ替えプロシージャ中に GFP 陽性細胞の精製されました。これは、成功を編集するため、遺伝子選別できる 96 クローンのピッキングに使用できる濃縮の許容可能なレベルだった。一般的に、成功した濃縮のためのカットオフは 50 %gfp 陽性。
並べ替えられたセルの人口の大半は非分裂細胞の核膜 (核周辺) に蛍光を表示され、有糸分裂提供する自信を持って正しいゲノム中に細胞質内の拡張核ラミナを LMNB1 で編集軌跡。豊かな人口には、明るいまたは暗い信号を持つセルが含まれています。この信号強度の違いは正しいと不適切な結果とハイライトの系統が遺伝的検証をさらに生成するユーティリティ研究 (説明参照) の編集の組み合わせを反映可能性があります (図 3 b)12。系統発生後検証顕微鏡実験 (図 3 c) で均一の GFP 強度を示した細胞が遺伝子。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig1.jpg"> 図 1.LMNB1 遺伝子の N 末端 GFP タグの戦略を設計する。GFP タグ染色体 5 にある LMNB1 の最初のエクソンの N ターミナル挿入 5ʹ 設計されました。5ʹ と 3ʹ の両方の相同性の武器は 1 kb と開始コドン (ATG) と 2 番目のコドン (ホモロジー腕だけ部分的に図で表される) との間を満たす。2 候補者 crRNAs まだゲノム内で一意でありながら、可能な限り目的の挿入サイトに近い切断する Cas9 をご案内しています。MEGFP とアミノ酸リンカーのシーケンスは開始コドン (ノンスケール mEGFP とリンカー順序) の挿入だけ 3ʹ.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58130/58130fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig2.jpg"> 図 2.タグ付きの内生生産ワークフローによる系統。トランスフェクション コンポーネント、ホモロジー腕 (HAs、金で示されている) を含むドナー テンプレート プラスミド (金 crRNA と紫の tracrRNA と赤の Cas9 蛋白質を示す)、Cas9/crRNA/tracrRNA RNP 複合体を含むと FP リンカー順序 (で示されている緑) +electroporated。4 日後推定編集 FP 陽性細胞 FACS による濃縮 96 ウェル プレート (1,000 〜 細胞) の単一ウェルに、細胞のすべてを播くことによって集団として拡大し、労働人口数百万のまで文化の拡大細胞が「豊かな人口」として試金することができる (プロトコル手順 3.8 を参照してください).FP 陽性細胞の収量は、HDR12; 可変レートの変動により実験によって異なります成功した濃縮は通常 300 〜 5,000 を含めることができます約 1.6 × 10 のトランスフェクション後のセル6腰セル。予備のイメージング研究は、豊かな人口の融合蛋白質の局在と信号を確認しました。コロニーは拡大し凍結保存のための 96 ウェル プレートに手動で選ばれました。ゲノムの品質管理審査をさらに液滴デジタルを使用して PCR (ddPCR) および他の PCR に基づく試金を使用して前述の12として正しく編集したクローンを識別します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58130/58130fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig3.jpg"> 図 3.推定編集したセル人口の濃縮します。(A) 、LMNB1 の流れの cytometry プロット編集セル 4 日後トランスフェクションします。Y 軸は、GFP の強度を表示し、x 軸表示前方散乱。並べ替えのゲートは、バッファー制御に基づいて設定しました。HiPSCs は摂動に敏感なのでライブ/デッド汚れが省略され、非常に保守的な FSC/SSC ゲートが代わりに使用されました。(B)濃縮後、LMNB1 Cr1 の人口編集細胞核封筒 (予想 LMNB1 局在) にローカライズする GFP と細胞の ~ 90% を示した。人口は、いくつかの GFP 陰性細胞と同様、程度は GFP の細胞に含まれています。スケール バーは、10 ミクロンです。(C)系統世代後の細胞は、細胞周期依存の違いと、均一な GFP 強度を示した。スケール バーは、20 ミクロンです。

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Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

人間でタグ内因性のタンパク質誘導多能性幹細胞 CRISPR/Cas9 を使用して

タグ内因のプロトコル CRISPR/Cas9 を用いたひと誘導多能性幹細胞の蛍光札が付いている蛋白質の表現は、ここで説明。推定編集されたセル、蛍光活性化細胞選別濃縮し、クローン細胞を生成します。

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

endogenous-protein-tagging-human-induced-pluripotent-stem-cells-using

Research

JoVE Journal

Genetics

26.0K ビュー.  Allen Institute for Cell Science. タグ内因のプロトコル CRISPR/Cas9 を用いたひと誘導多能性幹細胞の蛍光札が付いている蛋白質の表現は、ここで説明。推定編集されたセル、蛍光活性化細胞選別濃縮し、クローン細胞を生成します。

ビデオ: Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play in the functioning of cells and whole organisms. This cause has been tremendously aided by the recent introduction of the CRISPR/Cas9 system-a versatile tool that allows researchers to manipulate the genome and transcriptome in order to, among other things, knock out, knock down, or knock in genes in a targeted manner. For the purpose of knocking out a gene, CRISPR/Cas9-mediated double-strand breaks recruit the non-homologous end-joining DNA repair pathway to introduce the frameshift-causing insertion or deletion of nucleotides at the break site. However, an individual guide RNA may cause undesirable off-target effects, and to rule these out, the use of multiple guide RNAs is necessary. This multiplicity of targets also means that a high-volume screening of clones is required, which in turn begs the use of an efficient high-throughput technique to genotype the knockout clones. Current genotyping techniques either suffer from inherent limitations or incur high cost, hence rendering them unsuitable for high-throughput purposes. Here, we detail the protocol for using fluorescent PCR, which uses genomic DNA from crude cell lysate as a template, and then resolving the PCR fragments via capillary gel electrophoresis. This technique is accurate enough to differentiate one base-pair difference between fragments and hence is adequate in indicating the presence or absence of a frameshift in the coding sequence of the targeted gene. This precise knowledge effectively precludes the need for a confirmatory sequencing step and allows users to save time and cost in the process. Moreover, this technique has proven to be versatile in genotyping various mammalian cells of various tissue origins targeted by guide RNAs against numerous genes, as shown here and elsewhere.

The genotyping technique described here, which couples fluorescent polymerase chain reaction (PCR) to capillary gel electrophoresis, allows for high-throughput genotyping of nuclease-mediated knockout clones. It circumvents limitations faced by other genotyping techniques and is more cost effective than sequencing methods.

ハイスループットフォーマットでの遺伝子型CRISPR / Cas9媒介ノックアウト変異体に蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動法を用いました

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

遺伝学

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide RNA (sgRNA) that confers specificity, the Cas9 protein cleaves both DNA strands at the targeted locus. The DNA break can trigger either non-homologous end joining (NHEJ) or homology directed repair (HDR). NHEJ can introduce small deletions or insertions which lead to frame-shift mutations, while HDR allows for larger and more precise perturbations. Here, we present protocols for generating knockout cell lines by coupling established CRISPR/Cas9 methods with two options for downstream selection/screening. The NHEJ approach uses a single sgRNA cut site and selection-independent screening, where protein production is assessed by dot immunoblot in a high-throughput manner. The HDR approach uses two sgRNA cut sites that span the gene of interest. Together with a provided HDR template, this method can achieve deletion of tens of kb, aided by the inserted selectable resistance marker. The appropriate applications and advantages of each method are discussed.

Recent advances in the ability to genetically manipulate somatic cell lines hold great potential for basic and applied research. Here, we present two approaches for CRISPR/Cas9 generated knockout production and screening in mammalian cell lines, with and without the use of selectable markers.

哺乳類細胞におけるCRISPR / Cas9媒介遺伝子ノックアウトの選択依存性および独立した世代

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the African clawed frog, Xenopus, a longstanding model organism for biomedical research. Traditional breeding schemes for creating homozygous mutant lines with CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis have several time-consuming and laborious steps. To facilitate the creation of mutant embryos, particularly to overcome the obstacles associated with knocking out genes that are essential for embryogenesis, a new method called leapfrogging was developed. This technique leverages the robustness of Xenopus embryos to &#34;cut and paste&#34; embryological methods. Leapfrogging utilizes the transfer of primordial germ cells (PGCs) from efficiently-mutagenized donor embryos into PGC-ablated wildtype siblings. This method allows for the efficient mutation of essential genes by creating chimeric animals with wildtype somatic cells that carry a mutant germline. When two F0 animals carrying &#34;leapfrog transplants&#34; (i.e., mutant germ cells) are intercrossed, they produce homozygous, or compound heterozygous, null F1 embryos, thus saving a full generation time to obtain phenotypic data. Leapfrogging also provides a new approach for analyzing maternal effect genes, which are refractory to F0 phenotypic analysis following CRISPR/Cas9 mutagenesis. This manuscript details the method of leapfrogging, with special emphasis on how to successfully perform PGC transplantation.

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Genes essential for survival pose technical hurdles for creating mutant lines. Leapfrogging circumvents lethality by combining genome editing with primordial germ cell transplantation to create wild-type animals carrying germline mutations. Leapfrogging also permits the efficient generation of homozygous null mutants in the F1 generation. Here, the transplantation step is demonstrated.

アフリカツメガエルのリープフロッギング CRISPR/Cas9 ベースの始原生殖細胞の移植

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene function. Gene knockout has been used to study these gene functions in vivo. The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system is a powerful tool used to edit genomic DNA sequences to alter gene function. While the traditional approach has been to introduce CRISPR/Cas9 mRNA into the single cell embryos through microinjection, this can be a slow and inefficient process in catfish. Here, a detailed protocol for microinjection of channel catfish embryos with CRISPR/Cas9 protein is described. Briefly, eggs and sperm were collected and then artificial fertilization performed. Fertilized eggs were transferred to a Petri dish containing Holtfreter's solution. Injection volume was calibrated and then guide RNAs/Cas9 targeting the toll/interleukin 1 receptor domain-containing adapter molecule (TICAM 1) gene and rhamnose binding lectin (RBL) gene were microinjected into the yolk of one-cell embryos. The gene knockout was successful as indels were confirmed by DNA sequencing. The predicted protein sequence alterations due to these mutations included frameshift and truncated protein due to premature stop codons.

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

A simple and efficient microinjection protocol for gene editing in channel catfish embryos using the CRISPR/Cas9 system is presented. In this protocol, guide RNAs and Cas9 protein were microinjected into the yolk of one-cell embryos. This protocol has been validated by knocking out two channel catfish immune-related genes.

遺伝子編集アメリカナマズ、 Ictalurus イシガキダイ胚に CRISPR/Cas9 蛋白質のマイクロインジェクション

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration of transgenes. However, due to the low efficiency of homologous recombination (HR) and various indel mutations of non-homologous end joining (NHEJ)-based strategies in non-dividing cells, in vivo genome editing remains a great challenge. Here, we describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based CRISPR/Cas9 system for efficient in vivo precise targeted integration. In this system, the targeted genome and the donor vector containing homology arms (~800 bp) flanked by single guide RNA (sgRNA) target sequences are cleaved by CRISPR/Cas9. This HMEJ-based strategy achieves efficient transgene integration in mouse zygotes, as well as in hepatocytes in vivo. Moreover, a HMEJ-based strategy offers an efficient approach for correction of fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) mutation in the hepatocytes and rescues Fah-deficiency induced liver failure mice. Taken together, focusing on targeted integration, this HMEJ-based strategy provides a promising tool for a variety of applications, including generation of genetically modified animal models and targeted gene therapies.

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system provides a promising tool for genetic engineering, and opens up the possibility of targeted integration of transgenes. We describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based strategy for efficient DNA targeted integration in vivo and targeted gene therapies using CRISPR/Cas9.

CRISPR/Cas9 仲介の対象となる統合生体内で相同性を介した終わり参加ベースの戦略を使用して

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. Complete gene ablation in HSCs required the generation of knockout mice from which HSCs could be isolated, and gene ablation in primary human HSCs was not possible. Viral transduction could be used for knock-down approaches, but these suffered from variable efficacy. In general, genetic manipulation of human and mouse hematopoietic cells was hampered by low efficiencies and extensive time and cost commitments. Recently, CRISPR/Cas9 has dramatically expanded the ability to engineer the DNA of mammalian cells. However, the application of CRISPR/Cas9 to hematopoietic cells has been challenging, mainly due to their low transfection efficiencies, the toxicity of plasmid-based approaches and the slow turnaround time of virus-based protocols.
A rapid method to perform CRISPR/Cas9-mediated gene editing in murine and human hematopoietic stem and progenitor cells with knockout efficiencies of up to 90% is provided in this article. This approach utilizes a ribonucleoprotein (RNP) delivery strategy with a streamlined three-day workflow. The use of Cas9-sgRNA RNP allows for a hit-and-run approach, introducing no exogenous DNA sequences in the genome of edited cells and reducing off-target effects. The RNP-based method is fast and straightforward: it does not require cloning of sgRNAs, virus preparation or specific sgRNA chemical modification. With this protocol, scientists should be able to successfully generate knockouts of a gene of interest in primary hematopoietic cells within a week, including downtimes for oligonucleotide synthesis. This approach will allow a much broader group of users to adapt this protocol for their needs.

A protocol for fast CRISPR/Cas9-mediated gene disruption in mouse and human primary hematopoietic cells is described in this article. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins are introduced via electroporation with sgRNAs generated through in vitro transcription and commercial Cas9. High editing efficiencies are achieved with limited time and financial cost.

CRISPR/Cas9 によるマウスおよび人間の造血前駆細胞の高効率遺伝子破壊

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been co-opted as a powerful tool for precise eukaryotic genome engineering. Here, we present a rapid and simple method using chimeric single guide RNAs (sgRNA) and CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) for the efficient and precise generation of genomic point mutations in C. elegans. We describe a pipeline for sgRNA target selection, homology-directed repair (HDR) template design, CRISPR-Cas9-RNP complexing and delivery, and a genotyping strategy that enables the robust and rapid identification of correctly edited animals. Our approach not only permits the facile generation and identification of desired genomic point mutant animals, but also facilitates the detection of other complex indel alleles in approximately 4 - 5 days with high efficiency and a reduced screening workload.

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Here, we present a method to engineer the genome of C. elegans using CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins and homology dependent repair templates.

迅速かつ安易なパイプラインを生成する突然変異点ゲノムにc. の elegansを用いた CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical regions, is caused by infection with Plasmodium parasites. The development of more effective drugs to combat malaria can be accelerated by improving our understanding of the biology of this complex parasite. Genetic manipulation of these parasites is key to understanding their biology; however, historically the genome of P. falciparum has been difficult to manipulate. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been utilized in malaria parasites, allowing for easier protein tagging, generation of conditional protein knockdowns, and deletion of genes. CRISPR/Cas9 genome editing has proven to be a powerful tool for advancing the field of malaria research. Here, we describe a CRISPR/Cas9 method for generating glmS-based conditional knockdown mutants in P. falciparum. This method is highly adaptable to other types of genetic manipulations, including protein tagging and gene knockouts.

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

We describe a method for generating glmS-based conditional knockdown mutants in Plasmodium falciparum using CRISPR/Cas9 genome editing.

作る条件付き変異体の人間のマラリア原虫マラリアに CRISPR/Cas9 遺伝子の編集

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of CRISPR/Cas9 elements into the target cells by transfection is a prerequisite for efficient gene editing. This protocol demonstrates that tube electroporation (TE) machine-mediated delivery of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP), along with single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor templates to different types of mammalian cells, leads to robust precise gene editing events. First, TE was applied to deliver CRISPR/Cas9 RNP and ssODNs to induce disease-causing mutations in the interleukin 2 receptor subunit gamma (IL2RG) gene and sepiapterin reductase (SPR) gene in rabbit fibroblast cells. Precise mutation rates of 3.57%-20% were achieved as determined by bacterial TA cloning sequencing. The same strategy was then used in human iPSCs on several clinically relevant genes including epidermal growth factor receptor (EGFR), myosin binding protein C, cardiac (Mybpc3), and hemoglobin subunit beta (HBB). Consistently, highly precise mutation rates were achieved (11.65%-37.92%) as determined by deep sequencing (DeepSeq). The present work demonstrates that tube electroporation of CRISPR/Cas9 RNP represents an efficient transfection protocol for gene editing in mammalian cells.

Presented here is a protocol for efficient CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-mediated gene editing in mammalian cells using tube electroporation.

CRISPR/Cas9リボヌクレオタンパク質媒介精密遺伝子編集チューブエレクトロポレーション

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise heterozygous genetic modifications is challenging due to CRISPR-CAS9 mediated indel formation in the second allele. Here, we demonstrate a protocol to help overcome this difficulty by using two repair templates in which only one expresses the desired sequence change, while both templates contain silent mutations to prevent re-cutting and indel formation. This methodology is most advantageous for gene editing coding regions of DNA to generate isogenic control and mutant human stem cell lines for studying human disease and biology. In addition, optimization of transfection and screening methodologies have been performed to reduce labor and cost of a gene editing experiment. Overall, this protocol is widely applicable to many genome editing projects utilizing the human pluripotent stem cell model.

This protocol provides a method to facilitate the generation of defined heterozygous or homozygous nucleotide changes using CRISPR-CAS9 in human pluripotent stem cells.

ヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-CAS9を用いて定義されたゲノム修飾の生成

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...