この方法は、腎臓病の分野で重要な質問に答えるのに役立ちます。特に正常および罹患状態における糸球体の理解において。糸球体生物学は、様々な細胞型とそのユニークな構造のために研究が困難な場合があります。
この技術の主な利点は、簡単な方法と機器を使用して、無傷の糸球体の容易に利用可能なソースを提供することです。この技術は、正常および疾患腎臓における濾過障壁の理解に影響を及ぼす。特に、糸球体損傷が血清タンパク質の尿への異常に高い分泌につながるタンパク尿性慢性腎臓病の理解に光を当てることができます。
一般的に、この技術に新しい個人は、最終サンプルで十分な収率と純度を得ることが困難になります。手順を実証することは、私の研究室の技術者であるブリトニー・ラッシュです。まず、毛髪クリッパーを使用して安楽死させたラットの前腹部から毛髪を取り除きます。
70%エタノールを使用して、露出した皮膚を洗浄します。次に、手術用ハサミを使用して、皮膚に中線切開を行います。内臓を露出するには、筋層を通して正中線の切開を行います。
腎臓を見つけて隔離し、30ミリリットルのハンクの緩衝塩溶液またはHBSSを氷の上に置いた滅菌50ミリリットルプラスチック円錐形チューブに入れます。氷上のチューブを無菌細胞培養フードに移します。氷の上に置かれたHBSSの5ミリリットルを含む無菌ペトリ皿に腎臓を移す。
はさみと鋭利な鉗子を使って、色素の脂肪を取り除き捨てます。腎臓を取り巻くカプセルを取り除いて捨てるには、小さな表面切開を行い、鋭い鉗子を使って腎臓からそっと引き離します。5ミリリットルのHBSSを持つ2番目のペトリ皿の無菌ガーゼに腎臓を置き、各腎臓を中射矢セクションを通して半分に分けます。
メスを使用して、暗い色と中央の位置で識別できる髄質を取り除き、廃棄します。主に腎臓皮質を含む残りの部分を、5ミリリットルのHBSSを含む第3のペトリ皿に移す。滅菌カミソリの刃を使用して、ピースのサイズが1ミリメートル未満になるまで、またはペーストが形成されるまでミンチします。
1%BSA PBSを使用して、500ミリリットルの廃棄物ビーカーの上と底部を180マイクロメートルのふるいに濡らします。このステップは、ふるいをタンパク質でコーティングし、糸球体の付着を減少させ、歩留まりを改善するので非常に重要です。混合皮質をふるいの小さな端に置きます。
10ミリリットルの使い捨て注射器のテクスチャ付きプランジャーフランジを使用して、ふるいを通して氷の上に置かれた底鍋に組織をマッシュします。サンプル希釈を避け、底鍋に集めた流体を再利用してふるいをすすいでください。ふるいを完了した後、慎重に緩く接着糸球体をキャプチャするために、鍋の底からHBSSでふるいの底を洗います。
底の鍋からすべての流体を20ゲージ針を装備した10ミリリットルの注射器に分けます。針を通して流体を少なくとも3回下の鍋に通します。最後のコレクションでは、90マイクロメートルのふるいを通過する準備ができるまで、注射器に液体を含む糸球体を保管してください。
一方、底鍋を1%BSA PBSで洗い流し、廃ビーカーに洗います。1%BSA PBSを使用して90マイクロメートルのふるいの上部と下部を濡らし、底部の鍋の上に置きます。注射器のサンプルをふるいの1つの端に塗布します。
テクスチャ化されたプランジャーフランジを使用して、以前のようにふるいを通して組織をマッシュします。下部のパンから溶液を使用して組織を洗浄し、ふるいの1つの端からすべてを収集します。ふるいが完了したら、鍋の底からHBSSバッファーでふるいの底を慎重に洗い、緩やかに接着することができる任意の糸球体を捕捉します。
底部の鍋から50ミリリットルのプラスチック円錐形の管にすべての流体を集めます。1%BSA PBSを使用して、底鍋を廃ビーカーに洗います。その後、1%BSA PBSを使用して、75マイクロメートルのふるいの上部と下部を濡らします。
氷の上に置かれた底の鍋の上にふるいを置きます。液体が簡単に流れるふるいの1つの端にサンプルを適用します。1%BSA PBSの最低20ミリリットルでふるいの上部を無駄なビーカーに洗い流し、慎重にふるいの底を洗います。
75マイクロメートルのふるいの上部に残った糸球体を収集するには、ペトリ皿に糸球体を収集するために必要なだけ多くのHBSSでふるいを逆さまに洗い流します。ふるいにかけた糸状の糸球体を氷の上の50ミリリットルのプラスチック円錐形の管に集める。摂氏4度で5分間Gの1800倍の遠心分離機をした後、ピペットを使用して上清を慎重に取り除きます。
冷たいHBSSの10ミリリットルでペレットを再中断します。サンプルを組み合わせて遠心分離を繰り返します。糸球体は5ミリリットルのHBSSで再中断する。
総糸球体を数えるために、サンプルの10マイクロリットルの滴をガラススライドに置き、顕微鏡下で数え、500で倍数して総収量を得る。孤立した構造は、管状構造のないほぼすべての糸球体で構成されるべきである。チューブが存在し、ダウンストリームアプリケーションに影響を与える場合は、サンプル全体を90マイクロメートルのふるいに適用し、その時点以降のプロトコルを繰り返すことで除去できます。
ここで説明するプロトコルは、糸球体を単離する際に効率的であり、最終的な懸濁液は、95%を超える純度と管状セグメントまたは他の細胞タイプからの最小限の汚染を有する糸球体が密に詰まっている。これらの糸球体は、ヘマトキシリンおよびエオシン染色で染色して、それらの形態を見ることができる。さらに、処理後もプロトコル全体にわたってその構造を維持します。
それらは無傷で生き生き可能なポドサイト、メサンギアル細胞および内皮細胞を保持する。孤立した糸球体は、生体内病理をシミュレートするために化学的傷害にさらされている。具体的には糸球体濾過バリアの電荷を乱すプロタミン硫酸塩。
健康な糸球体とは対照的に、プロタミン硫酸処理糸球体は、WT1に対してネフロンおよび多数の核陽性の顕著な減少を有する。透過電子顕微鏡で見ると、健康な糸球体は典型的な足のプロセスを示す。プロタミン硫酸処理後、足のプロセスは、ポドサイト損傷を示す細長いまたは汚れている。
単離糸球体での細胞生存率を決定するために、切断カスパーゼ3はアポトーシスマーカーとして観察された。糸球体の分離後、ゼロと1時間後に切断カスパーゼ3はありませんでした。いくつかの細胞は、時間の経過とともに進行性の増加と2時間と4時間でアポトーシスの徴候を示した。
アポトーシス細胞の最大数は24時間と48時間で注目された。これらの結果に基づいて、ほとんどの実験では、分離直後に分離糸球体を使用することをお勧めします。この手順を実行する場合、迅速かつ効率的に作業することが重要です。
腎臓が単離された瞬間から、糸球体が悪化し始める。糸球体を素早く分離すればするほど、ポーズ、隔離、操作にかかる時間が増えます。単離後、単離された糸球体は、生理学的または病理学的状態を刺激するために化学的または生物学的薬剤にさらされる可能性がある。
そして、標本はタンパク質またはRNAの単離、構造学または免疫蛍光および電子顕微鏡のためのプロセスであり得る。1950年代の開発以来、この技術は、糸球体生物学の研究に研究者を支援してきました。全体として、このプロトコルは、正常および罹患状態における無傷の糸球体の形態学的および細胞特性を評価する方法を提供する。
この方法は、タンパク尿性慢性腎臓病の理解を助け、将来の治療法の開発に役立ちます。
