安定した蛍光ミトコンドリアを有する不死化糸球体内皮細胞は、in vitroでミトコンドリア構造に対するさまざまな刺激の影響を調べるための優れたツールです。本論文に記載されている方法は、多数の糸球体内皮細胞を生じる。GECで低分子を試験することにより、GECが罹患している糖尿病性腎疾患の単剤療法をスクリーニングすることができます。
説明されている方法は実行が簡単で、特定の機器を必要としません。ただし、汚染を避けるために、説明されている手順に従い、機器を滅菌することが重要です。まず、腎糸球体細胞を単離するために必要な灌流および分離材料をワークスペースに配置します。
新しく調製したハンクスバランス塩溶液(HBSS)を0.2ミクロンのフィルターでろ過し、汚染を避けるためにボンネットの下に保管してください。次に、200マイクロリットルの磁気ビーズと20ミリリットルのHBSSを混合します。RPMIを10%FCSと内皮細胞培養培地で摂氏37度のウォーターバスで予熱します。
次いで、6ウェルプレートの2つのウェルに2ミリリットルの10マイクログラム当たり1ミリリットルのコラーゲンIVを室温で45分間プレコートする。プレートをPBSで2回洗浄して、コラーゲンの希釈に使用した酢酸を除去します。コーティングされたプレートをすぐに使用するか、摂氏2〜8度で最大4週間保管してください。
手術器具と作業スペースを70%エタノールで洗浄します。続いて、手術器具を30分間オートクレーブする。麻酔をかけたマウスの腹部を開いた後、左心室に蝶の針を挿入します。
血液循環を拡大するために100マイクロリットルのビーズ溶液を注入するには、腎臓の下の下大静脈を19ゲージの針で慎重に破り、ビーズ溶液の灌流を続けます。次に、ピンセットで脂肪組織をそっと取り除き、細い手術用ハサミCで両方の腎臓を切除し、氷の上に1ミリリットルのHBSSを入れたプレートに置きます。滅菌メスで腎臓を1ミリメートルの小片にひきます。
細かく刻んだ腎臓を1ミリメートルの新しく調製したコラゲナーゼII型で摂氏37度で35分間インキュベートし、水平シェーカーを穏やかに傾けます。消化後、10%FBSを含む4ミリリットルのRPMIを加えてコラゲナーゼを中和します。消化された組織を滅菌済みの100ミクロンセルストレーナーを通して50ミリリットルのチューブにろ過します。
滅菌した1.5ミリリットルのチューブの底を使用して、消化された組織をストレーナーに対して攪拌し、糸球体を通過させます。セルストレーナーを15ミリリットルのHBSSですすいでください。次に、フロースルーを 200 XG で室温で 5 分間遠心分離します。
この段階で、チューブは3つの層を含みます。上層は細管などの小さな構造を含み、中間層は糸球体を有するビーズであり、そして最下層は破片を含む。上清と一番上の白い層を注意深く吸引します。
次に、糸球体と破片を含むビーズを含むペレットを1.5ミリリットルのHBSSに再懸濁し、2ミリリットルのチューブに移します。チューブを磁気濃縮器に入れ、上清を吸引してから、ビーズを1ミリリットルのHBSSで2回洗浄します。20マイクロリットルの細胞懸濁液をスライド上に置きます。
次に、糸球体の存在について顕微鏡下でスライドを観察します。次に、ペレットを内皮細胞増殖培地に再懸濁し、懸濁液を2ミリリットルのチューブに移します。培地3ミリリットルごとに1マイクロリットルのインターフェロンガンマを加え、細胞を6ウェルプレートに入れて摂氏33度でインキュベートします。
3日間の培養後、1ミリリットルの培地を新しい培地と慎重に交換します。この段階では、細胞は糸球体細胞の混合物と不均一である。7日後、培地を2ミリリットルの新鮮な内皮細胞増殖培地と交換し、インターフェロンガンマを添加して細胞の増殖を開始します。
10日後、細胞が80%コンフルエントに達したら、トリプシンを使用して継代し、コラーゲンIVでコーティングされたT-25フラスコに移します.21日間の培養後、細胞をT-75フラスコに移します。3ミリリットルの0.25%トリプシンをT-75フラスコに加え、細胞を摂氏37度で5分間インキュベートします。次に、3ミリリットルの内皮増殖培地でトリプシンを中和し、懸濁液を15ミリリットルのチューブに移して、200 XGで5分間遠心分離します。
上清を吸引し、1%BSA、2ミリモルEDTA、1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含む1ミリリットルのPBSで細胞を洗浄します。再度、遠心分離し、ペレットを200マイクロリットルのCD31抗体被覆ビーズおよび800マイクロリットルのPBSに再懸濁する。摂氏37度と5%二酸化炭素で連続的に振とうしながら、細胞を45分間インキュベートします。
次に、チューブを磁気濃縮器に入れ、BSA、EDTA、およびペニシリン/ストレプトマイシンを含むPBSで細胞を4回洗浄します。最後の洗浄後、インターフェロンガンマを添加した3ミリリットルの内皮増殖培地に細胞を再懸濁する。コラーゲンIVコーティングウェルに1ウェルあたり1.5ミリリットルの細胞を6ウェルプレート上にプレートし、摂氏33度の許容条件下で培養する。
4日後、750マイクロリットルの培地をインターフェロンガンマを添加した新鮮な内皮増殖培地と交換する。10〜14日間の培養後、488ナノメートルのフィルターを備えた落射蛍光顕微鏡を使用して、蛍光ミトコンドリアを発現するコロニーであるCD31陽性糸球体内皮細胞(GEC)の増殖を観察します。21日後、または細胞が80〜90%コンフルエントに達したら、それらをT-25フラスコに移します。
10%FCSを含むRPMI増殖培地で培養を維持します。あるいは、細胞を凍結保存することもできる。継代細胞は、先に実証したようにトリプシンを用いた。
次に、細胞を遠心分離し、ペレットを3ミリリットルの凍結培地に再懸濁します。細胞をクライオチューブに分注し、液体窒素、蒸気温度で保存します。このプロトコールは、糸球体内皮細胞の単離のための方法を記載した。
単離された糸球体から、細胞は3日間の培養後にゆっくりと成長し始めました。7日後、細胞は不均一に見え、足細胞、頭頂細胞、上皮細胞、メサンギウム細胞などの他の糸球体細胞タイプを示しました。70〜80%のコンフルエントに達した後、他の糸球体細胞を、内皮細胞のポジティブ選択を用いて除去した。
MitoDendra2 GECはCD31を発現し、シナプトポジン陰性染色によって示されるように、足細胞マーカーに対して陰性であった。ミトコンドリア構造に対するグルコース濃度の影響を調べた。正常なグルコース下の細胞に見られる細長いミトコンドリアと比較して、高グルコースは、顕著なスフェロイド形状のミトコンドリアによって観察されるように、ミトコンドリアの断片化または分裂を誘発した。
さらに、405ナノメートルのレーザーを使用して、単一の生きたMitoDendra2GECでミトコンドリアの選択された亜集団を光変換しました。正常および高グルコース濃度で処理された細胞について、選択された領域でミトコンドリアの緑から赤への光切り替えに成功したことが示されています。この切り替えにより、MitoDendra2 GECでの核融合イベントを目撃することができました。
通常のグルコース下では、ミトコンドリアマトリックス融合により黄色の緑色と赤色の蛍光が融合した。対照的に、高グルコース処理GECでは、ミトコンドリアは主に断片化されていました。少量の増殖培地を含む6ウェルプレートの1ウェルに細胞を配置することは、細胞をディッシュに付着させるために不可欠です。
単離された内皮細胞は、ミトコンドリアの機能および構造研究を行うために使用することができる。蛍光ミトコンドリアの特徴を持つ不死化内皮細胞の使用は、創薬への道を開くでしょう。低分子は細胞上でテストすることができ、ミトコンドリア機能への影響を調べるためにライブイメージングが実行されます。
