この方法は、有糸分裂ネットワークの背後にある調節メカニズムや細胞周期時計の動的特性と機能など、システム生物学分野の主要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、それぞれに複数の細胞周期を持つ大量の液滴を生成し、定量的な操作と分析のためのハイスループットフレームワークを提供することです。まず、動物と植物の極の間に不明瞭な境界を持つ卵のバッチ、または動物の極の上に不規則な白い斑点を捨てます。
次に、1匹のメスのカエルから卵の適切なバッチを選択し、卵を600ミリリットルのビーカーに移します。0.2倍のMMRバッファーを過剰に注ぎ、卵に1xエキスバッファーにシステインを静かに加えます。その後、ビーカーを手で激しく振って、卵のゼリーコートを取り除きます。
合計800ミリリットルのシステインバッファーで、または卵が凝集し、ビーカーの底に落ち着くまで、この洗浄を3回繰り返します。ゼリーコートを取り除いた後、卵を0.2倍MMR溶液の1リットルで4回洗います。ガラスピペットを使用して、白くなる卵を拾って捨てます。
ビーカーからMMRバッファーを注ぎ、卵に200ミリリットルのイオノフォア溶液を加えます。ガラスピペットを使用して卵が活性化されるまで軽くかき混ぜ、イオノフォアカルシウム溶液を取り除きます。卵をあまりにも長くイオノフォア溶液に残すと、アポトーシスが始まります。
卵を1.5分間かき混ぜ、活性化効率を確認します。活性化されていない場合は、撹拌を再開し、90%活性化が達成されるまでより頻繁に確認してください。卵がビーカーの底に落ち着いたら、活性化効率を確認してください。
よく活性化された卵は、動物の極の約25%と植物極の75%を有する。次に、プロテアーゼ阻害剤を添加した抽出バッファーの総容量50ミリリットルで卵を2回洗浄する。その後、慎重に0.4ミリリットルのスナップキャップマイクロチューブに卵を転送します。
マイクロチューブを200gで60秒間遠心分離し、その後600gで30秒間送心して卵を詰めます。次に、ガラスパスツールピペットを使用して、各ステップの後に卵の上に余分なバッファーを取り除きます。この後、卵を摂氏4度で10分間10分間15,000gで粉砕します。
カミソリの刃を使用してチューブを切断し、破砕卵の3層を分離し、粗い細胞質を中間層に保ちます。次いで、粗い細胞質を超遠心チューブを洗浄するために移します。細胞質をプロテアーゼ阻害剤とサイトカラシンBをそれぞれ1ミリリットルあたり10マイクログラムで補います。
粗細胞質を15,000g、摂氏4度で5分間遠心します。次に、カミソリの刃を使用してチューブを切断し、中間層に細胞質を保ちます。作りたてのエキスを氷の上に置きます。
まず、準備した抽出物にセクチン-mCherry mRNAを加えます。次に、抽出液mRNA混合物に2%PFPE-PEGフルオロサーファクタントの200マイクロリットルを加える。渦ミキサーを使用して液滴を生成し、必要に応じて渦の速度と持続時間を調整します。
次に、液滴を視覚的に検査して、サイズが均一であることを確認します。200マイクロリットルのピペットを使用して、上に浮かぶ液滴と同量の界面活性剤をPCRチューブに移します。ガラス管を液滴層に浸し、液滴がチューブの約75%を満たすまで待ちます。
次いで、チューブを界面活性剤層に押し込み、チューブを完全に充填します。次に、ガラス底の皿にミネラルオイルを入れます。次に、細かいピンセットを使用して、液滴入りチューブを油に浸します。
ガラスピペットを使用して、目に見える破片や漏れた液滴を取り除きます。液滴の動きや漏れを避けるために、液滴で満たされたガラス管は慎重に鉱物油の下に浸漬する必要があります。バランスで両端のチューブを押すか、最初にチューブの端にミネラルオイルを数滴同時に加えることができます。
この後、電動のキシステージを搭載した蛍光顕微鏡を使用して、液滴を画像化します。明るいフィールドと複数の蛍光チャンネルで、液滴が活動を失うまで、6〜9分ごとにタイムラプスビデオを記録します。このプロトコルを用いて、核を持つ単純な核のない細胞と複雑な細胞の両方で有糸振動が生じ出された。
核のない液滴は、92時間にわたって最大30回の未減衰サイクルの有糸分裂を発生させた。また、下流の有糸分裂性事象を駆動する有糸発振器の能力も調べた。自立した有糸球体発振器は、異なる細胞周期相の自律的変化を通じて観察された核形態の変化を推進した。
この手順を試みる間、それは時間に敏感であるように、抽出物を作るときの時間を覚えておくことが重要であり、常に氷の上に卵と抽出物を保ちます。その開発後、この技術は、システム生物学の分野の研究者が、ゼノプス・ラエビスのタンタンビリティやストカスティシティのような複雑な時計特性の基本原理を探求する道を開いた。
