Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Systembiologie zu beantworten, wie z. B. den Regelungsmechanismus hinter dem mitotischen Netzwerk und die dynamischen Eigenschaften und Funktionen der Zellzyklusuhr. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie eine große Menge von Tröpfchen mit jeweils mehreren Zellzyklen erzeugt und uns ein Hochdurchsatz-Framework für quantitative Manipulation und Analyse bietet. Um zu beginnen, entsorgen Sie Chargen von Eiern, die unklare Grenzen zwischen tierischen und vegetalischen Polen oder unregelmäßigen weißen Flecken auf tierischen Polen haben.
Als nächstes wählen Sie eine entsprechende Charge Eier von einem weiblichen Frosch, und übertragen Sie die Eier auf ein 600-Milliliter-Becher. Gießen Sie einen Überschuss von 0,2x MMR-Puffer, und fügen Sie Cystein in 1x ExtraktPuffer zu den Eiern. Danach den Becher kräftig von Hand schütteln, um die Geleemäntel der Eier zu entfernen.
Wiederholen Sie diese Wäsche dreimal mit insgesamt 800 Milliliter Cysteinpuffer oder bis die Eier sich aggregieren und am Boden des Bechers absetzen. Nachdem das Gelee-Mantel entfernt wurde, waschen Sie die Eier viermal in einem Liter 0,2x MMR-Lösung. Verwenden Sie eine Glaspipette, um die Eier, die weiß werden, aufzunehmen und zu entsorgen.
Gießen Sie den MMR-Puffer aus dem Becher, und fügen Sie 200 Milliliter Calciumionophorlösung in die Eier. Verwenden Sie eine Glaspipette, um die Eier sanft zu rühren, bis sie aktiviert werden, und entfernen Sie die Calcium-Ionophor-Lösung. Wenn die Eier zu lange in Calciumionophorlösung gelassen werden, wird dies eine Apoptose initiieren.
Wir rühren die Eier 1,5 Minuten lang und überprüfen die Aktivierungseffizienz. Wenn sie nicht aktiviert sind, fahren Sie mit dem Rühren fort, und überprüfen Sie häufiger, bis eine 90%ige Aktivierung erreicht ist. Nachdem sich die Eier am Unteren Rand des Bechers absetzen, überprüfen Sie die Aktivierungseffizienz.
Gut aktivierte Eier haben etwa 25% des Tierpols und 75% des Gemüsepols. Als nächstes waschen Sie die Eier zweimal mit einem Gesamtvolumen von 50 Milliliter Nextraliter Naderpuffer, ergänzt mit Protease-Inhibitoren. Dann die Eier vorsichtig auf ein 0,4-Milliliter-Snap-Cap-Mikrotube übertragen.
Zentrifugieren Sie das Mikrorohr 60 Sekunden lang bei 200 g und dann 30 Sekunden lang bei 600 g, um die Eier einzupacken. Verwenden Sie dann eine glasende Pasteurpipette, um den überschüssigen Puffer auf den Eiern nach jedem Schritt zu entfernen. Danach die Eier bei 15.000 g 10 Minuten bei vier Grad Celsius zerdrücken.
Verwenden Sie eine Rasierklinge, um die Rohre zu schneiden, um die drei Schichten von zerkleinerten Eiern zu trennen und das rohe Zytoplasma in der mittleren Schicht zu halten. Dann übertragen Sie das rohe Zytoplasma, um Ultrazentrifugenrohre zu reinigen. Ergänzen Sie das Zytoplasma mit Protease-Inhibitoren und Cytochalasin B bei jeweils 10 Mikrogramm pro Milliliter.
Zentrifugieren Sie das rohe Zytoplasma bei 15 000 g und vier Grad Celsius für fünf Minuten. Verwenden Sie dann eine Rasierklinge, um das Rohr zu schneiden und das Zytoplasma in der mittleren Schicht zu halten. Die frisch zubereiteten Extrakte auf Eis legen.
Fügen Sie zunächst securin-mCherry mRNA zu den vorbereiteten Extrakten hinzu. Als nächstes fügen Sie dem Extrakt mRNA-Gemisch 200 Mikroliter 2%PFPE-PEG-Fluorosursidans hinzu. Verwenden Sie einen Wirbelmischer, um Tröpfchen zu erzeugen und die Wirbelgeschwindigkeit und -dauer nach Bedarf anzupassen.
Überprüfen Sie dann die Tröpfchen visuell, um sicherzustellen, dass sie einheitlich sind. Mit einer 200-Mikroliter-Pipette die auf der Oberseite schwebenden Tröpfchen und ein gleiches Tensidvolumen auf ein PCR-Rohr übertragen. Tauchen Sie ein Glasrohr in die Tröpfchenschicht, und warten Sie, bis die Tröpfchen etwa 75% des Rohres füllen.
Dann schieben Sie das Rohr in die Tensidschicht, und füllen Sie das Rohr vollständig. Als nächstes füllen Sie eine Schale mit Glasboden mit Mineralöl. Dann verwenden Sie eine feine Pinzette, um das mit Tröpfchen gefüllte Rohr in das Öl einzutauchen.
Verwenden Sie eine Glaspipette, um sichtbare Trümmer oder ausgelaufene Tröpfchen zu entfernen. Um Bewegung und Leckage von Tröpfchen zu vermeiden, sollte das mit Tröpfchen gefüllte Glasrohr sorgfältig unter Mineralöl getaucht werden. Wir können entweder die Röhre an beiden Enden mit Dembalese schieben oder zuerst ein paar Tropfen Mineralöl an die Enden des Rohres geben.
Verwenden Sie anschließend ein Epifluoreszenzmikroskop, das mit einer motorisierten xy-Stufe ausgestattet ist, um die Tröpfchen abzubilden. Nehmen Sie Zeitraffervideos im hellen Feld und mehrere Fluoreszenzkanäle alle sechs bis neun Minuten auf, bis die Tröpfchen ihre Aktivität verlieren. Mit diesem Protokoll wurden mitotische Oszillationen sowohl in einfachen, kernfreien Zellen als auch in komplizierten Zellen mit Kernen hergestellt.
Die kernfreien Tröpfchen erzeugten mitotische Schwingungen bis zu 30 undamped Zyklen über 92 Stunden. Die Fähigkeit des mitotischen Oszillators, nachgeschaltete mitotische Ereignisse anzutreiben, wurde ebenfalls untersucht. Der selbsttragende mitotische Oszillator trieb die Veränderungen der kerntechnischen Morphologie voran, die durch die autonome Veränderung verschiedener Zellzyklusphasen beobachtet wurden.
Beim Versuch dieses Verfahrens, Es ist wichtig, die Zeit bei der Herstellung des Extraktes zu beachten, da es zeitempfindlich ist, und halten Sie immer die Eier und Extrakt auf Eis. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Systembiologie, um grundlegende Prinzipien komplexer Uhreigenschaften wie Tunabilität und Stochasticity in Xenopus laevis zu erforschen.
