Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области системной биологии, такие как механизм регулирования митотической сети и динамические свойства и функции часов клеточного цикла. Основным преимуществом этого метода является то, что он будет генерировать большое количество капель с несколькими циклами клеток в каждом, предоставляя нам высокую пропускную способность для количественных манипуляций и анализа. Для начала отбросьте партии яиц, которые имеют неясные границы между животными и вегетативными полюсами или нерегулярными белыми пятнами поверх полюсов животных.
Затем выберите соответствующую партию яиц из одной самки лягушки и перенесите яйца в стакан на 600 миллилитров. Вылейте избыток 0,2x MMR буфера, и осторожно добавить цистеин в 1x буфер экстракт яйца. После этого, встряхнуть стакан энергично вручную, чтобы удалить желе пальто яиц.
Повторите эту стирку три раза в общей сложности 800 миллилитров буфера цистеин или до тех пор, пока яйца агрегат и поселиться в нижней части стакана. После того, как желе пальто удаляется, мыть яйца четыре раза в один литр 0,2x MMR раствора. Используйте стеклянную пипету, чтобы забрать и отказаться от яиц, которые побелеют.
Налейте буфер MMR из стакана, и добавить 200 миллилитров раствора ионофора кальция в яйца. Используйте стеклянную пипетку, чтобы аккуратно перемешать яйца, пока они не активированы, и удалить раствор ионофора кальция. Оставляя яйца в растворе ионофора кальция слишком долго будет инициировать апоптоз.
Мы перемешиваем яйца в течение 1,5 минут и проверяем эффективность активации. Если они не активированы, возобновите перемешивание и проверяйте чаще, пока не будет достигнуто 90%активация. После того, как яйца оседают на дне стакана, проверьте эффективность активации.
Хорошо активированные яйца имеют примерно 25% полюса животных и 75% растительного полюса. Затем мыть яйца дважды с общим объемом 50 миллилитров экстракт буфера дополняется ингибиторами протеазы. Затем осторожно перенесите яйца на микротрубку на 0,4 миллилитров.
Центрифуга микротрубки в течение 60 секунд при 200 г, а затем при 600 г в течение 30 секунд, чтобы упаковать яйца. Затем используйте стеклянную пипетку Pasteur, чтобы удалить избыток буфера поверх яиц после каждого шага. После этого измельчите яйца при 15 000 г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.
Используйте лезвие бритвы, чтобы разрезать трубки, чтобы отделить три слоя измельченных яиц и сохранить сырую цитоплазму в среднем слое. Затем перенесите сырую цитоплазму для очистки ультрацентрифуговых трубок. Дополнить цитоплазму ингибиторами протеазы и цитохалазином В по 10 микрограммов на миллилитр каждый.
Центрифуга сырой цитоплазмы при 15 000 г и 4 градусах Цельсия в течение пяти минут. Затем используйте лезвие бритвы, чтобы вырезать трубку и сохранить цитоплазму в среднем слое. Поместите свежеприготовленные экстракты на лед.
Во-первых, добавить securin-mCherry mRNA к подготовленным экстрактам. Далее добавьте 200 микролитров 2%PFPE-PEG фторсурфактанта в смесь экстракта мРНК. Используйте вихревой смеситель для генерации капель, регулируя скорость вихря и продолжительность по мере необходимости.
Затем визуально осмотрите капли, чтобы убедиться, что они однородны по размеру. Используя 200-микролитровую пипетку, перенесите плавающие сверху капли и равный объем сурфактанта в трубку ПЦР. Опустите стеклянную трубку в слой капель и подождите, пока капли заполнят примерно 75% трубки.
Затем, нажмите трубку в слой сурфактанта, и заполнить трубку полностью. Затем заполните блюдо со стеклянным дном минеральным маслом. Затем используйте тонкие пинцеты, чтобы погрузить заполненные каплями трубки в масле.
Используйте стеклянную пипету для удаления видимых обломков или протекающих капель. Чтобы избежать движения и утечки капель, стеклянная трубка, наполненная каплями, должна быть тщательно погружена под минеральное масло. Мы можем либо нажать трубку на обоих концах с балансом или добавить несколько капель минерального масла на концах трубки одновременно в первую очередь.
После этого используйте эпифлюоресценции микроскоп оснащен моторизованной стадии XY для изображения капель. Запись замедленного видео в ярком поле и несколько каналов флуоресценции каждые шесть-девять минут, пока капли теряют свою активность. Используя этот протокол, были произведены митотические колебания как в простых, безядерных клетках, так и в сложных клетках с ядрами.
Безядерные капли генерируют митотические колебания до 30 неутмперированных циклов в течение 92 часов. Была также изучена способность митотического осциллятора управлять митотичами ниже по течению. Самостоятельный митотический осциллятор привел к изменениям ядерной морфологии, наблюдаемым в результате автономного изменения различных фаз клеточного цикла.
При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы помнить время при принятии экстракта, так как это время чувствительных, и всегда держать яйца и экстракт на льду. После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей в области системной биологии, чтобы исследовать фундаментальные принципы сложных свойств часов, таких как настройки и стохастичность в Xenopus laevis.
