この方法は、がん研究やがん治療などの基礎研究や臨床応用における重要な質問に答えるだけでなく、免疫学分野においても答えることができます。この方法の主な利点は、それが静的な方法であり、容易に容易になりやすいということです。この技術は、その形状および動き特性に基づいて、病気の細胞タイプを自動的に識別することができる。
この技術の意味は、がんまたは炎症性疾患の診断と治療にまで及ぶ。この方法は、免疫細胞とがん細胞の間の行動に関する洞察を提供することができますが、3次元顕微鏡データが必要な分野でも適用できます。この方法に新しい個人は、3次元顕微鏡データを記述し、検証する問題のために苦労するかもしれません。
この方法の視覚的なデモンストレーションは、ここで使用するソフトウェアツールが多くの科学者にとって馴染みがないため、非常に重要であると考えました。まず、付属のテキスト プロトコルで説明されているように、高解像度のデコンボルブ 3 次元顕微鏡データ セットを取得します。3D イメージ データを再構築ソフトウェアにロードし、各オブジェクトの 3D サーフェスの作成を開始します。
これを行うには、[3D ビュー]オプションを選択して[サーフェス]をクリックし、[次へ]ボタンをクリックしてサーフェス作成ウィザードを続行します。次に、サーフェス再構成用のイメージ チャネルを選択します。サーフェスの詳細を隠さないだけでなく、多孔質サーフェスを回避するスムージング値を選択します。
スムーズオプションチェックボックスをクリックし、スムージング半径を指定して、スムージング機能を適用します。顕微鏡データの3次元画像構造を作成する場合、細胞特性や形状を失わないように、平滑化係数と適切な閾値法に注意することが特に重要です。次に、サーフェスを検索するしきい値方法を選択します。
ここに示すようなオブジェクトが背景から十分に分離され、ほぼ均一な輝度レベルを持つ場合は、絶対強度しきい値を使用します。オブジェクトの強度が変化するが、ローカル背景とそれらを取り巻く他のオブジェクトから引き離すことができる場合は、ローカルコントラストしきい値を適用します。再構築されたオブジェクトの予想直径の値に従って、ローカルしきい値検索領域を設定します。
次に、目的の形態学的パラメータに従って再構成されたサーフェスをフィルタリングするオプションのリストから選択します。これには、体積、球面性、サーフェス対体積比などが含まれます。生成されたサーフェスを、次のステップで使用する 3D アニメーション ソフトウェアと互換性のある VRML などの形式で保存およびエクスポートします。
Blender を起動し、ウィンドウの右側にある [出力] タブに移動します。ドロップダウンメニューから TIFF 形式を選択し、色深度を 8 ビット RGBA に設定します。次に、スクリプト モードに切り替え、指定されたスクリプト ファイルに移動しますタイトル:GUI_Autorotate。
この作業の github リポジトリからダウンロードできます。メインウィンドウに戻り、[スクリプトの実行]をクリックし、入力を求められたら wrl ファイルのフォルダを選択します。次に、デフォルトメニューに移動します。
ここでは、回転を 6 以上の値に設定します。[回転]ボタンをクリックしてスクリプトを実行します。通常、6つの異なる角度の回転で、異なる細胞集団を区別するのに十分ですが、形状や特性に関する情報を失わないように、6回転未満を使用することはお勧めしません。
入力に使用されたのと同じフォルダに、個々のサーフェスの投影を保存します。デフォルトでは、画像は、フィジープラグイン、Shadeで必要な形式である8ビットのTIFF形式で保存されます。フィジーを開き、プラグインメニューで「シェード」を選択します。
デフォルト値から始め、後でパラメーターを微調整します。プログラムを実行する準備ができたら、[問題ありません] をクリックします。次に、前のセクションで作成した TIFF ファイルを含むソース フォルダを選択し、[選択] をクリックします。
次に、出力データ フォルダーを指定します。最初の画像が表示されたら、セルの周囲に四角形を描き、まず[OK]をクリックします。プラグインが実行されると、赤い線で示されるセルの周辺の画像の前処理が表示されます。
見つかったエッジの座標が、離散フーリエ成分の計算に使用されるようになりました。初めて自己組織化マップをトレーニングするには、MATLAB をロードして開始します。TrainSOM MATLAP スクリプトを読み込み、実行を選択してトレーニングを開始します。
必要に応じて、ファイルのパスを正しく指定してください。実行が開始されると、追加のウィンドウがポップアップして進行状況が表示されます。トレーニングが完了するまで待ってから、続行してください。
既定では、スクリプトは 2,000 回の反復処理またはエピックを実行するように設定されています。トレーニングが終了したら、ネットワークのトポロジ プロットを調べます。次に、隣接距離プロット、サンプルヒットプロット、入力平面プロットの例を示します。
自己組織化マップは、データセット内の隠れた関係を発見するための重要なツールです。データを客観的にクラスター化し、教師なしの学習を行うため、トレーニング データ セットは必要ないという利点があります。これでネットワークのトレーニングが行われます。
ワークスペース内のファイルを右クリックし、後で使用するために保存します。既にトレーニング済みのマップを使用する場合に、データ セットをクラスター化するために、自己組織化マップを読み込みます。次に、事前にロードされたトレーニング済みマップを使用してテストする CSV ファイルをインポートします。
ここでは、シェードプラグインのCSV出力を選択します。データが読み込まれたら、出力タイプを数値マトリックスに変更し、[選択をインポート]を選択します。分類が完了したら、コマンド ウィンドウを使用してさまざまなプロットを評価します。
ここでの画像は、ミクログリア細胞のデコンボルブインビトニエンタルマルチフォトンミスクロシスコピーデータセットから来たものである。生理学的条件下では、ミクログリアは、複数の高度に分岐したプロセスを有するかなり複雑な形状を提示した。この皮質腫瘍モデルのような癌性環境に置くと、ミクログリアはより単純でスピンドル状の形状に変化した。
これらのフォーニア型の徴兵コンポーネントのうち20個は、自己組織化マップを訓練するための入力として使用された。訓練された地図は、健康な細胞と癌細胞を区別する能力を評価するためにテストされました。健康な細胞集団は、ここで示す単一の領域に投影されたのに対し、癌性ミクログリアデータセットはダンベル型の活性領域として提示された。
地図はまた、異なる細胞群を識別するために医療専門家によって訓練することができます。ここで、休止細胞、貪食細胞、相互作用細胞、および移動細胞を、同定、再構成、および12x12マップのトレーニングに使用した。この結合されたマップは、特にマップの左下と中央の領域で、ヒット値の大きい人工ニューロンのグループを示しています。
マッピングアプローチの堅牢性は、トレーニングデータセットの一部ではない同じ静止セルタイプの3つのランダムなサブセットを持つ訓練された自己組織化マップを使用してテストされました。この入力に対するS.O.Mの応答は、正しいセルタイプを示す非常によく似た応答を示します。この技術の開発後、私たちは簡単に細胞の形状の変化を分類できるツールキットを持っています。
これらの変化は、例えば癌中、または他の免疫系応答の間に起こり、顕微鏡検査、動物全体、切除された組織、あるいはチップ上の器官を使用してそれらを測定することができる。
