進行性大腸癌を再現するマウスへの患者由来癌細胞の同所性移植

このプロトコルは免疫不全のマウスの盲腸壁の患者得られた癌細胞の同所性移植を記述する。このモデルは、進行した結腸直腸癌の転移性疾患を再現します。ここで紹介する同所性大腸がんモデルは、患者由来のオルガノイドや患者由来の異種移植モデルでは研究できない大腸がん患者の進行性腸腫瘍および転移性疾患の臨床シナリオを再現しています。

安楽死させたマウスから、ハサミと鉗子を使用して、皮膚および周囲の非腫瘍組織から腫瘍を慎重に除去することにより、腫瘍を抽出します。摘出した腫瘍を摂氏4度のPBSに入れます。ブレードを使用して、1ミリメートルの培地を含む10センチメートルの培養プレートで腫瘍を解離します。

均質に解離したサンプルを15ミリリットルのコニカルチューブに入れます。次に、培地を5ミリリットルの最終容量に加えます。次に、消化培地をチューブに加えます。

チューブを細胞培養インキュベーター内の45度の位置に置き、摂氏37度で1時間待ちます。1時間のインキュベーション中は、15分ごとに5ミリリットルのピペットで溶液を混合します。インキュベーション後、5ミリリットルの培地を加えてよく混ぜます。

次に、滅菌済みの50ミリリットルチューブを使用して、100マイクロメートルのセルストレーナーで溶液を選別します。選別した細胞を500gで室温で10分間遠心分離します。上清を吸引し、ペレットを 3 ミリリットルの 1x RBC Lysis Buffer 溶液に再懸濁します。

室温で10分間インキュベートします。次に、3ミリリットルの培地を加え、サンプルを混合します。室温で500gで10分間遠心分離し、上清を吸引する。

ペレットを5〜10ミリリットルの培地で再懸濁し、セルカウンターを使用して細胞の総数を計算します。細胞を室温で500gで10分間遠心分離した後、10ミリリットルのPBSに再懸濁します。遠心分離を繰り返し、10ミリリットルのPBSで洗浄します。

ペレットを再懸濁して、10倍の濃度を10倍から6細胞/ミリリットルとし、よく混合して均質な細胞懸濁液を得る。次に、盲腸注射用の29gシリンジを用意します。50マイクロリットルの腫瘍細胞懸濁液をシリンジにロードし、シリンジに気泡が残っていないことを確認します。

シリンジを氷の上に置きます。まず、消毒洗剤を噴霧して拭き取るなどして手術部位を殺菌します。その後、マウス脱毛機で腹部を脱毛します。

マウスを仰臥位に置き、クロルヘキシジンまたはポビドンヨードでこすって腹部を消毒します。手術用ハサミを使用して、下腹部を縦方向に1センチメートル切開します。皮膚を慎重に横に分離して、腹膜を露出させます。

次に、盲腸を外在化するのに十分な腹膜を0.5〜1センチメートル切開します。事前にカットされた滅菌ガーゼを使用して、マウスから盲腸を慎重に分離します。処置全体を通して盲腸を生理食塩水で湿らせた。

鉗子で慎重に保持して盲腸を固定し、針を盲腸壁に表面的に導入します。ゆっくりと、50マイクロリットルの腫瘍細胞懸濁液全体を注入します。このプロセスには約 10 秒かかります。

注射後、盲腸からゆっくりと針を抜き、綿先アプリケーターで注射部位に穏やかな圧力をかけます。盲腸を生理食塩水で洗浄して破片を取り除き、盲腸を動物の腹部に戻します。5/0縫合糸を使用して腹膜を閉じ、次に5/0縫合糸を使用して腹部の皮膚を閉じます。

患者由来のがん細胞を移植したマウスの腸に同所性CRC-PDX腫瘍が観察された。盲腸のヘマトキシリン染色とエオシン染色による組織学的分析により、腫瘍細胞の存在が示されました。組織学的解析により、移植マウスの肺転移と肝転移も明らかになりました。

同所性腫瘍を保有するマウスを、ビヒクル、試験薬、または化学療法薬イリノテカンのいずれかで治療した。マイクロCTスキャン画像の解析では、ビヒクルと比較して、検査薬は腫瘍体積の減少を誘発し、イリノテカン治療との併用でさらに減少することが示されました。このモデルは、大腸癌腫瘍の転移の生物学を研究するのに役立ちます。