この方法は、RNAタンパク質複合体を単離し、質量分析によってその組成を同定しようとしている研究者に興味深いはずです。私たちのプロトコルは、限られた量の細胞に存在し、長い多段階の精製手順の間に解約する傾向がある複合体を浄化するのに特に有用であると考えています。この方法の主な利点は、単一の精製ステップのみを含み、任意の長さおよび配列のRNA結合部位で使用できることです。
いくつかのステップを実証するのは、私たちのグループの上級研究技術者であるXiao-cui Yangです。65ヌクレオチドよりかなり長い結合部位については、テキストプロトコルに概説されているように、T7生成されたRNAおよびアダプタPCBオリゴヌクレオチドを得る。結合バッファーの100マイクロリットルを含む1.5ミリリットルチューブにアダプターオリゴヌクレオチドの100ピコモールとRNAの20ピコモールを混合します。
沸騰したお湯にチューブを入れ、5分間インキュベートさせます。その後、水を室温まで冷却します。最初のサプリメント 1 ミリリットルのマウス核エキス 80 ミリモル EDTA で pH 8 で最終濃度 10 ミリモル.
次に、PCB部分でタグ付けされたRNA基質の5〜10個のピコモールを加えます。氷の上で5分間インキュベートし、サンプルを時折混ぜるようにします。次に、摂氏4度で予冷したマイクロ遠心分離機を使用して、混合物を10,000倍のgで10分間遠心し、潜在的な沈殿物を除去します。
慎重にペレットを転送しないように注意しながら、氷上の新しいチューブに上清を収集します。約100マイクロリットルのストレプトアビジンアガロースビーズ懸濁液を1.5ミリリットルチューブに移します。約1ミリリットルの結合バッファーを加えると、ビーズの洗浄を開始します。
チューブを2〜3分間25回gで遠心分離し、上清を吸引する。この洗浄および遠心分離プロセスを2〜3回繰り返し、ビーズを結合バッファーと平衡化した。平衡ビーズ上に組み立てられた複合体を含む、以前に収集された上清をロードします。
チューブ回転器を使用して、チューブを摂氏4度で1時間回転させ、RNAと結合複合体をビーズに固定します。次に、チューブを2〜3分間25回gで回転し、チューブの底部にあるビーズを収集します。上清を吸引する。
ビーズを結合バッファーで2回リンスし、先に説明した洗浄プロセスを用いた。2回目の洗浄の上清を取り除いた後、1ミリリットルの結合バッファーを加え、サンプルを摂氏4度で1時間回転させます。2〜3分間、25回gでサンプルをスピンダウンします。
次に、1ミリリットルの結合バッファーを追加し、懸濁液を新しいチューブに移します。サンプルを摂氏4度で1時間回転させます。固定化された複合体を25回gで2〜3分間遠心する。
次いで吸気上清、200マイクロリットルの結合緩衝液を加えた。ビーズを500マイクロリットルチューブに移します。365ナノメートルでUV光を発する高輝度のUVランプをオンにし、それが完全な輝きに達することを可能にします。
ペトリ皿の底を、皿のふたの上にしっかりと詰めた氷で満たします。固定化された複合体を含む管を簡単に渦する。その後、氷の上に水平に置き、あらかじめ温めたランプで覆い、サンプルが電球の表面から2〜3センチメートルであることを確認します。
均一な露出を確保し、過熱を防ぐために、チューブを頻繁に反転させ、ボルテックスしながら、サンプルを合計30分間照射します。この後、25回gで2〜3分間ビーズを回転させ、上清を集めます。遠心分離この上清は、同じ条件を使用してもう一度。
得られた上清を収集し、残存ビーズの転写を避けるために、チューブの底部に少量を残すことを確認してください。SDS-PAGE電気泳動を使用して、UV溶出した上清の一部と、UV溶出後のビーズに残された材料から対応する分数を分離します。次に市販の銀染色キットを用いてゲルを染色する。
UV溶出した上澄み物に存在するタンパク質と、UV照射後のビーズに残っているタンパク質の強度を比較して、UV溶出の効率を評価します。目的のタンパク質バンドを物品化し、質量分析法によってそのアイデンティティを決定します。この後、質量分析法によりUV溶出した上澄みの分画を直接分析し、精製物のプロテオーム全体を公平に決定する。
本研究では、フォトクレアブルビオチンでタグ付けされた幹細胞ループRNAを、マウス骨髄腫細胞から得られた細胞質S100抽出物の1ミリリットルでインキュベートした。そして、UV溶出の効果と効率を、銀染色により解析する。UV溶出前にレンサビジンビーズで多くのタンパク質が検出されます。
長波UVによる照射は、これらのタンパク質の一部のみを上清に放出し、ビーズに非特異的な背景を残します。これは UV 溶出ステップの重要性を強調する。質量分析は、主要なUV溶出タンパク質を3'hExoおよびSLBPと同定し、SLBPは全長タンパク質と多数の短い分解産物の両方で表される。
様々なRNA結合タンパク質として同定された他のタンパク質の少量も、UV照射によって選択的に溶液中に放出される。核抽出物でインキュベートされたフォトクレアブルビオチンでタグ付けされた固定化ショウジョウバエヒストンプレmRNAのUV溶出は、ビーズに残っている非特異的タンパク質の強烈な背景を有する少数のタンパク質のみを上清に選択的に放出した。質量分析は、U7 snRNPの成分であるこれらのタンパク質を同定する。
それらはヒストンプレmRNAへのU7 snRNPの結合をブロックする処理競争相手の存在下で検出されない。高輝度のUVランプを使用し、照射されたサンプルに近い距離に置き、過熱しないようにすることも重要です。UV溶出法は、主要な汚染物質を欠く天然RNAタンパク質複合体を生成し、追加の精製工程および機能アッセイに直接適しています。
紫外線照射時の眼や皮膚への露出は避けてください。
