この研究は、退役軍人事務所職業訓練賞1IK2BX001701、CTSA賞UL1TR000445、翻訳科学進歩センター、国立科学財団賞番号1547757および1400969、およびNIHグラントGM05551によって支持されました。その内容は、著者の責任であり、必ずしも移民科学振興機関または国立衛生研究所の公式見解を示すものではありません。

1.S100A12の発現<ol><li>コンピテントBL21 DE3細胞を、標準熱ショックプロトコール18を用いてpGEMEX-S100a12プラスミドで形質転換する。氷上の微量遠心管内で50μLの細菌に1〜5μLのプラスミドを添加する。 20分間インキュベートする。 </li><li>細胞を42℃で30秒間熱ショックする。 </li><li>細胞を氷上で2分間インキュベートする。 </li><li> 500μLのSOC培地を細胞に添加する。オービタルシェーカー上で250rpmで振とうしながら37℃で1時間インキュベートする。 </li><li> LB寒天培地（100μg/ mLアンピシリン添加）で150μLの形質転換反応をプレートする。 37℃で12〜16時間インキュベートする。 </li><li>一つのコロニーを選ぶ。 LB（100μg/ mLアンピシリンを補充）2mLを接種する。 </li><li>オービタルシェーカー（300 rpm）で37℃で4〜6時間インキュベートする。 OD 600は、1〜3の吸光度単位を読み取る必要があります。 </li><li> 50μLのZYM-5052 autoinduに500μLのスターター培養液を加えます100μg/ mLのアンピシリンを補充した培地で処理した。最良の通気と最大の発現のために、250mLのバッフル付き三角フラスコを使用してください。 37℃で24時間振とう（300rpm）。 </li><li>細菌懸濁液を遠心管に移す。 4℃で遠心分離（4,000×g、10分間）して細胞をペレット化する。 </li><li>培地をデカントし、サンプルを記録し、-80℃で細胞ペーストを保存する。サンプルは何年も安定しています。 </li></ol>低圧クロマトグラフィーを用いたS100A12の精製<ol><li> 30mLの20mMトリス、pH8.0中で細胞を再懸濁する。 </li><li>懸濁液を氷上で超音波処理して細胞を溶解する。 〜20W出力、5秒オン、5秒オフサイクルを5分間使用する。 </li><li>溶液を高速遠心管に移す。 4℃で30分間、20,000×gで遠心分離することにより、細胞溶解物を明確にする。 </li><li>上清を傾瀉し、清浄な100mLポリプロピレンビーカーに移す。ビーカーを氷上に置いて溶液を冷却する。攪拌棒を追加する11.20gの硫酸アンモニウムをゆっくり加える。溶液を氷上でさらに1時間撹拌する。これにより、硫酸アンモニウムの60％溶液が生成され、ほとんどの大腸菌内在性タンパク質が沈殿する。 S100A12は可溶性のままです。 </li><li>溶液を4℃、20,000 xgで20分間遠心分離し、沈殿したタンパク質をペレット化する。 </li><li>上清を捨て、透析チューブ（MWCO3,500 kDa）に移す。 4℃で1Lの20mM Tris（pH8.0）に対して透析する。透析バッファーを2回交換してください。変更の間に4時間を許可します。 </li><li> 陰イオン交換クロマトグラフィー <ol><li>低圧系でクロマトグラフィーを行う。典型的な流速は1mL /分である。 </li><li> 10mLの20mM Tris（pH8.0）で5mLセファロースカラムを平衡化する。 </li><li>サンプルポンプを使用して〜40 mLのS100A12溶液をロードします（フロースルーを収集します）。 </li><li> 10mLの20mM Tris（pH8）でカラムを洗浄する。 </li><li> 0〜30％の勾配でカラムを現像する（BuBカラムは19カラム容量（CV、95mL）で20mMトリス、pH8.0,1M NaClである。 5 mLの画分を集める。 </li><li>各画分の10μLアリコートをとり、MOM SDS PAGEを用いてクマシー染色で分析します。定電圧（20V / cm）で30分間ゲルを流します。 </li><li> S100A12を含むプール画分。 S100A12は、変性ゲル上で約10kDaタンパク質で作動する。 </li><li>限外濾過装置（MWCO 10kDa）を用いて画分を5mLに濃縮する。 3,000×gで約8分間遠心分離する。一番上の部分を取る。 </li></ol></li><li> サイズ排除クロマトグラフィー <ol><li> S75カラムを1 CV（120 mL）の20 mM Tris pH 8,100 mM NaClで平衡化する。 </li><li> 5mLの濃縮S100A12画分を（イオン交換クロマトグラフィーから）注入する。 </li><li>カラムを1 mL / mの流速で120 mL以上に展開する。 5 mLの画分を集める。 </li><li>各画分の10μLアリコートを取り、SDS PAGEを用いてクマシー染色を用いて分析する。タンパク質の同一性を確認するウェスタンブロットまたは質量分析（単量体サブユニット10,575.0Daの計算分子量、10575.4Daで測定）。 </li></ol></li><li> プール分 <ol><li>分光光度計を用いてプロテインA 280の吸光度を測定する。 SECバッファをブランクとして使用してください。 S100A12ホモ二量体の計算吸光係数は5960M -1 cm -1である 。 注：典型的な収量は50 mLの培養あたり35〜45 mgのS100A12です。 </li><li>アリコートS100A12を1.5 mLのマイクロ遠心チューブ（1 mg /チューブ）に入れ、液体窒素で急速凍結し、-80°Cで保存します。 </li></ol></li></ol> 3.抗菌活性アッセイ<ol><li> 5％ヒツジ血液（血液寒天プレート）を補充したトリプシン大豆寒天プレート上にG27株を播種する。 5％二酸化炭素を補充した室内空気中、37℃で2〜3日間増殖させる。 </li><li> 1×コレステロールを補充したBrucellaブロスにH.pyloriを接種する。文化的5％二酸化炭素を補充した室内空気中、37℃で一晩振とう（250rpm）。 </li><li> H.pylori 1:10を50％Brucella broth、50％calprotectin buffer + 1x cholesterolに希釈し、100μM塩化亜鉛プラス0,100,1,000μg/ mL精製S100A12を添加した培地で培養する。 5％二酸化炭素を補充した室内空気中、37℃で一晩振とう培養（250rpm）。 </li><li>翌日、連続希釈を行い、血液寒天プレート上にプレートする。細菌コロニーを5％二酸化炭素を補充した室内空気で37℃で2〜3日間生育させる。コロニー形成単位を列挙して、S100A12および/または外来性亜鉛の存在下または非存在下での細菌増殖を計算する。 </li></ol>

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著者らは、競合する金銭的利益がないと宣言している。

ヒトS100A12の発現および精製の両方のための効率的なプロトコールが提示される。 E.coli発現系は、特にmg量が生化学的および生物物理学的研究のために必要とされる場合、組換えタンパク質の製造に使用される最も一般的なツールである。ここに記載されている手順の重要な強化は、標準的なルリアブロス培地18での発現と比較して、精製タンパク質の収率をほぼ30倍?...

S100タンパク質は、機能の多様な配列を有するカルシウム結合タンパク質のEFハンドファミリーのクラスである1 。それらは組織および細胞特異的様式で発現され、広範囲の細胞機能を調節する2,3 。カルシウム結合タンパク質に特有のS100タンパク質は、細胞内および細胞外の両方の機能を発揮します4,5 。細胞内では、Ca 2+結合は、タンパク質結合パートナー6を特異的に標的とする疎水性表面を露出する構造変化を誘導する。この細胞内機構は、細胞増殖、分化およびエネルギー代謝などの重要な過程を調節する。細胞外環境では、S100タンパク質は2つの機能を示す7 。 1つは、それらは損傷関連分子パターン（DAMP）タンパク質として作用し、炎症促進性サイトカインパターン認識受容体8,9 との相互作用による免疫性免疫応答。さらに、S100タンパク質クラスのいくつかのメンバーは、栄養免疫と呼ばれる過程で微生物病原体を飢餓にさせる働きをする転移金属を封鎖する10,11 。 S100A12（カルグラヌリンCおよびEN-RAGEとしても知られている）は、マクロファージおよび好中球において高度に発現され、炎症性疾患の潜在的なバイオマーカーとして同定されている12,13。そのEF-Hand部位でカルシウムを結合することに加えて、S100A12は、ダイマー界面14,15の反対側に位置する2つの高親和性遷移金属結合部位を有する。各結合部位は、3つのヒスチジン残基および1つのアスパラギン酸残基を含み、亜鉛または銅をキレートすることができるsup class = &quot;xref&quot;&gt; 16,17。最近、我々は、S100A12依存性亜鉛欠乏が、 ヘリコバクターピロリの成長および炎症誘発性病原因子の活性を調節する上で重要であることを報告した18 。 ピロリ菌は世界中の人口の約半分の胃に感染する。間違いなく最も成功した細菌病原菌の一つとなっている19 。 H.pyloriによる感染は、胃炎、消化性および十二指腸性潰瘍、粘膜関連リンパ組織（MALT）リンパ腫、および浸潤性胃腺癌（胃癌）を含む重大な胃疾患の転帰につながり得る。胃癌は、世界の非心臓癌関連死の主要な原因であり、胃癌の1つの最も大きな関連する危険因子は、 H.pyloriの感染である。 ヘリコバクターピロリはロブにもかかわらず胃のニッチに存続するこの細菌感染を制御する免疫機構のより良い理解の必要性を強調している20,21,22,23。 H.pylori関連炎症は、感染部位にS100A12を含む抗菌タンパク質のレパートリーを沈着させる多形核細胞または好中球の深い浸潤によって特徴付けられる18,24,25。宿主と病原体の複雑な対話を理解するために、我々はS100A12を精製し、この医学的に関連する病原体に及ぼす抗菌作用を研究する技術を改良しようとした。以下のプロトコルは、生物学的に活性な状態でのS100A12精製のための改良技術を概説する。高い親和性を有する栄養素を結合する能力それらを侵入する微生物からキレートする。さらに、以下の方法は、本来の抗菌分子が細菌病原体の増殖を制限する機構を研究するための重要な試薬として、このタンパク質の有用性を強調している。 S100Aファミリータンパク質は、免疫シグナル伝達および宿主防御に関与する先天性免疫系分子の重要なグループとして評価されてきた27 。これらの中で最もよく研​​究されているものは、カルプロテクチン（MRP-8/14、カルグラニュリンA / B、S100A8 / A9） 28,29,30 である。カルプロテクチンは、二量体界面31で遷移金属に結合するS100A8およびS100A9サブユニットのヘテロ二量体を形成する好中球関連タンパク質である。カルプロテクチンは、2つの金属結合部位を有することが示されている：部位1は、Zn 2+ 、Mn 2+ 、またはFe 2+に結合することができ、部位2は、<html> Zn 2+ 31,32に結合する。カルプロテクチンは、黄色ブドウ球菌 、 カンジダ・アルビカンス 、 アシネトバクター・バウマンニ 、 クレブシエラ・ニューモニエ 、 エシェリヒア・コリ 、およびヘリコバクター・ピロリを含む様々な病原体に対して抗菌活性を有すること、ならびにカルプロテクチンの金属キレート化活性に起因することが、 、 29 。 以前の研究は、カルプロテクチンが、外膜の脂質A構造の改変、（ ヘリコバクターピロリ中の主要な前炎症性ビルレンス因子である）カギIV型分泌系の抑制、バイオフィルム形成の誘発、および抑制を含むヘリコバクターピロリに対する多数の活性を発揮することを示したピロリ菌の増殖と生存率は用量依存的にclass = &quot;xref&quot;&gt; 25,33。さらに、遺伝的および生化学的アッセイにより、 ヘリコバクター・ピロリに対するカルプロテクチンの抗菌活性は、栄養素に結合する能力に大きく起因することが明らかになった25 。 ピロリ菌は、この病原体が増殖し増殖するための微量栄養素要求を確認するために化学的に規定された培地を利用した以前の研究によって決定されたように、亜鉛を必要とする34 。さらに、カルプロテクチンは、 H.pylori感染組織内に非常に豊富であり、好中球浸潤物と関連しており、感染およびその後の炎症の際の抗菌戦略として宿主がカルプロテクチンを使用する可能性があることを示しているバイアスプロテオミクススクリーニング技術からの最近の証拠は、反応性酸素種が豊富な条件下では、カルプロテクティブスズは、ヘキサ - ヒスチジン結合部位を変える翻訳後修飾を受け、それによってタンパク質36の金属結合活性を阻害する。このように、本発明者らは、これらの分子の広いレパートリーの中の他のS100Aファミリータンパク質が補助金属キレート化剤として潜在的に作用する可能性があると仮説した。我々は、上記の翻訳後修飾についてのスクリーニングで同定されておらず、亜鉛に結合する能力を有し、 H.pylori感染個体由来のヒト組織において非常に豊富であるため、さらなる研究のためにS100A12を選択した。 本発明者らの研究は、S100A12がH.pyloriの G27株において用量依存的にH.pyloriの増殖および生存を阻害し、このタンパク質の抗菌活性が過剰栄養素亜鉛の添加によって逆転され得ることを示している。この研究は、S100A12がPMSS1および7.1に対する抗菌活性を示した以前の研究を補完するH. pyloriの 3菌株であり、多数の臨床分離株および実験室で適応されたH.pylori菌株に対する広範な抗菌活性を示している18 。総合すると、これらの結果は、S100A12が栄養免疫による細菌の増殖と増殖を制御するメカニズムとして重要であることを確認しています。この重要な宿主 - 細菌相互作用の将来の研究には、宿主組織内の細菌負荷を低減するためのS100A12の活性を利用すること、またはH.pylori感染に関連して免疫シグナル伝達に対するこのタンパク質の寄与を決定することが含まれる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>S100A12 Expression</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expression cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL 21 (DE3) competent cells</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C25271</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoinduction medium components</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>Y20020-250.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>S23020-500.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>T60060-250.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2877</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>M65240-100.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>S23100-500.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>P41200-500.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A20424-500.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2SO4</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>S25150-500.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>G22020-1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>G32040-500.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lactose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2643</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selection agent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A40040-5.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100A12 Purification</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Start Chromatography System</td>
			<td>GE</td>
			<td>29-220-94</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Q Sepharaose Fast Flow</td>
			<td>GE</td>
			<td>17-5156-01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiPrep 16/60 S-200 HR</td>
			<td>GE</td>
			<td>17-1166-01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop lite spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-LITE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>T60040-1000.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H. pylori Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood agar plates</td>
			<td>Lab Supply Company</td>
			<td>BBL221261</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brucella broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B3051</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol (250X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12531018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>793566</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>229997</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression, purification, and antimicrobial activity of s100a12

カルグラニュリンタンパク質は先天性免疫の重要なメディエーターであり、カルシウム結合タンパク質のEFハンドファミリーのS100クラスのメンバーである。いくつかのS100タンパク質は、遷移金属を高親和性で結合し、「栄養免疫」と呼ばれる過程において、それらを侵入する微生物病原体から効果的に隔離する能力を有する。 S100A12（EN-RAGE）は亜鉛と銅の両方に結合し、マクロファージや好中球などの生来の免疫細胞に非常に豊富に存在します。本発明者らは、S100A12の活性金属結合構成における発現、濃縮および精製のための洗練された方法を報告する。このタンパク質の細菌増殖および生存度分析における利用は、S100A12が細菌病原体であるヘリコバクター・ピロリに対して抗菌活性を有することを示している。抗菌活性は、栄養素の亜鉛をキレート化するS100A12の亜鉛結合活性を前提としており、これにより、成長およびpに亜鉛を必要とするH.pyloriが飢えているロリファーション。

S100A12の発現および精製 3段階の精製により、50mLの細菌培養液から約40mgの組換えS100A12を産生した。第一段階は、内因性大腸菌（E.coli）タンパク質の硫酸アンモニウム沈殿であった 。この工程の後に、陰イオン交換クロマトグラフィー（ 図 1A ）を行った。タンパク質は、クーマシーブ?...

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Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

ここでは、S100A12（calgranulin C）を発現、精製する方法を紹介します。我々は、ヒト病原体H.ピロリに対するその抗菌活性を測定するためのプロトコルを記載する。

S100A12の発現、精製および抗菌活性

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

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Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug used to treat depression and anxiety by binding to the serotonin transporter with high-affinity, blocking serotonin reuptake. Here we report an efficient procedure and a set of tools to stabilize, express, purify, and crystallize serotonin transporter-antibody complexes bound to S-citalopram and other antidepressants. Mutations which stabilize the serotonin transporter were identified using an S-citalopram binding assay. Serotonin transporter expressed in baculovirus-transduced HEK293S GnTI- cells, was reconstituted into proteoliposomes and used to raise high-affinity antibodies. We have developed a strategy to discover antibodies that are useful for structural studies. A straightforward approach for the expression of antibody fragments in Sf9 cells has also been established. Transporter-antibody complexes purified using this procedure are well-behaved and readily crystallize, producing complexes with S-citalopram that diffract X-rays to 3-4 &#197; resolution. The strategies developed here can be utilized to determine the structure of other challenging membrane proteins.

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

This manuscript describes how to screen for thermostabilizing mutations, purify the human serotonin transporter, generate high affinity antibodies, and crystallize the serotonin transporter-antibody complex bound to the antidepressant drug S-citalopram. This protocol can be adapted to the study of other challenging membrane transporters, receptors, and channels.

にバインドされた熱安定、発現、精製、およびヒトセロトニントランスポーターの結晶化<em&gt; S</em&gt; - シタロプラム

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

生化学

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- channel (CaCC) predominantly expressed in retinal pigment epithelium (RPE). The physiological and pathological significance of BEST1 is highlighted by the fact that over 200 distinct mutations in the BEST1 gene have been genetically linked to a spectrum of at least five retinal degenerative disorders, such as Best vitelliform macular dystrophy (Best disease). Therefore, understanding the biophysics of bestrophin channels at the single-molecule level holds tremendous significance. However, obtaining purified mammalian ion channels is often a challenging task. Here, we report a protocol for the expression of mammalian bestrophin proteins with the BacMam baculovirus gene transfer system and their purification by affinity and size-exclusion chromatography. The purified proteins have the potential to be utilized in subsequent functional and structural analyses, such as electrophysiological recording in lipid bilayers and crystallography. Importantly, this pipeline can be adapted to study the functions and structures of other ion channels.

The purification of ion channels is often challenging, but once achieved, it can potentially allow in vitro investigations of the functions and structures of the channels. Here, we describe the stepwise procedures for the expression and purification of mammalian bestrophin proteins, a family of Ca2+-activated Cl- channels.

哺乳類 Bestrophin イオン チャネルの発現と精製

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a chemical defense because it has antimicrobial activity and is considered a natural insecticide. Caffeine can also produce negative allelopathic effects that prevent the growth of surrounding plants. In addition, people around the world consume caffeine for its analgesic and stimulatory effects. Due to interest in the technological applications of caffeine, research on the biosynthetic pathway of this compound has grown. These studies have primarily focused on understanding the biochemical and molecular mechanisms that regulate the biosynthesis of caffeine. In vitro tissue culture has become a useful system for studying this biosynthetic pathway. This article will describe a step-by-step protocol for the quantification of caffeine and for measuring the transcript levels of the gene (CCS1) encoding caffeine synthase (CS) in cell suspensions of C. arabica L. as well as its activity.

This protocol describes an efficient methodology for the extraction and quantification of caffeine in cell suspensions of C. arabica L. and an experimental process for evaluating the enzymatic activity of caffeine synthase with the expression level of the gene that encodes this enzyme.

カフェイン抽出、酵素活性、植物細胞懸濁液からのカフェイン合成酵素の遺伝子発現

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic purification methods. This manuscript illustrates the technical details involved in the anaerobic purification process, including the preparation of buffers and reagents, the methods for column chromatography in a glove box, and the desalting of the protein prior to kinetics. Also described are the methods for preparing and using an oxygen electrode to perform kinetic characterization of an oxygen-utilizing enzyme. These methods are illustrated using the dioxygenase enzyme DesB, a gallate dioxygenase from the bacterium Sphingobium sp. strain SYK-6.

Here we present a protocol for anaerobic protein purification, anaerobic protein concentration, and subsequent kinetic characterization using an oxygen electrode system. The method is illustrated using the enzyme DesB, a dioxygenase enzyme which is more stable and active when purified and stored in an anaerobic environment.

嫌気性蛋白質の浄化および DesB ジオキシゲナーゼ活性と抑制の勉強用酸素電極による速度論的解析

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium homeostasis, particularly store-operated calcium entry, which is critical to maintaining proper function of synaptic vesicle release and intracellular signaling pathways. Accordingly, TRPC channels have been implicated in a variety of human diseases including cardiovascular disorders such as cardiac hypertrophy, neurodegenerative disorders such as Parkinson&#39;s disease, and neurologic disorders such as spinocerebellar ataxia. Therefore, TRPC channels represent a potential pharmacologic target in human diseases. However, the molecular mechanisms of gating in these channels are still unclear. The difficulty in obtaining large quantities of stable, homogeneous, and purified protein has been a limiting factor in structure determination studies, particularly for mammalian membrane proteins such as the TRPC ion channels. Here, we present a protocol for the large-scale expression of mammalian ion channel membrane proteins using a modified baculovirus gene transfer system and the purification of these proteins by affinity and size-exclusion chromatography. We further present a protocol to collect single-particle cryo-electron microscopy images from purified protein and to use these images to determine the protein structure. Structure determination is a powerful method for understanding the mechanisms of gating and function in ion channels.

This protocol describes techniques used to determine ion channel structures by cryo-electron microscopy, including a baculovirus system used to efficiently express genes in mammalian cells with minimum effort and toxicity, protein extraction, purification, and quality checking, sample grid preparation and screening, as well as data collection and processing.

式と単一粒子の低温電子顕微鏡による構造決定のための人間脂質感受性陽イオン チャネル TRPC3 の精製

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also known as Band 3), the most abundant membrane protein in the red blood cells. The SLC4 family is homologous with borate transporters, which have been characterized in plants and fungi. It remains a significant technical challenge to express and purify membrane transport proteins to homogeneity in quantities suitable for&#160;structural or functional studies. Here we describe detailed procedures for the overexpression of borate transporters in Saccharomyces cerevisiae, isolation of yeast membranes, solubilization of protein by detergent, and purification of borate transporter homologs from S. cerevisiae, Arabidopsis thaliana, and Oryza sativa. We also detail a glutaraldehyde cross-linking experiment to assay multimerization of homomeric transporters. Our generalized procedures can be applied to all three proteins and have been optimized for efficacy. Many of the strategies developed here can be utilized for the study of other challenging membrane proteins.

Here we present a protocol to express, solubilize, and purify several eukaryotic borate transporters with homology to the SLC4 transporter family using yeast. We also describe a chemical cross-linking assay to assess the purified homomeric proteins for multimeric assembly. These protocols can be adapted for other challenging membrane proteins.

式、可溶化、および真核生物ホウ酸輸送体の浄化

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, fluorophores are prone to loss of signal via photobleaching by dissolved oxygen (O2). To prevent photobleaching and extend the fluorophore lifetime, oxygen scavenging systems (OSS) are employed to reduce O2. Commercially available OSS may be contaminated by nucleases that damage or degrade nucleic acids, confounding interpretation of experimental results. Here we detail a protocol for the expression and purification of highly active Pseudomonas putida protocatechuate-3,4-dioxygenase (PCD) with no detectable nuclease contamination. PCD can efficiently remove reactive O2 species by conversion of the substrate protocatechuic acid (PCA) to 3-carboxy-cis,cis-muconic acid. This method can be used in any aqueous system where O2 plays a detrimental role in data acquisition. This method is effective in producing highly active, nuclease free PCD in comparison with commercially available PCD.

Protocatechuate 3,4-dioxygenase (PCD) can enzymatically remove free diatomic oxygen from an aqueous system using its substrate protocatechuic acid (PCA). This protocol describes the expression, purification, and activity analysis of this oxygen scavenging enzyme.

ヌクレアーゼフリー酸素スカベンジャープロトカテク酸プロトカテクエート3,4-ジオキシゲナーゼの発現と精製

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this superfamily generally display multi-functionality, involving mainly hydrolase and decarboxylase mechanisms. This article presents a series of consecutive methods for the expression and purification of FAHD proteins, mainly FAHD protein 1 (FAHD1) orthologues among species (human, mouse, nematodes, plants, etc.). Covered methods are protein expression in E. coli, affinity chromatography, ion exchange chromatography, preparative and analytical gel filtration, crystallization, X-ray diffraction, and photometric assays. Concentrated protein of high levels of purity (&#62;98%) may be employed for crystallization or antibody production. Proteins of similar or lower quality may be employed in enzyme assays or used as antigens in detection systems (Western-Blot, ELISA). In the discussion of this work, the identified enzymatic mechanisms of FAHD1 are outlined to describe its hydrolase and decarboxylase bi-functionality in more detail.

Expression and purification of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins is described with examples (expression in E. coli, FPLC). Purified proteins are used for crystallization and antibody production and employed for enzyme assays. Selected photometric assays are presented to display the multi-functionality of FAHD1 as oxaloacetate decarboxylase and acylpyruvate hydrolase.

フマリアルセトーアセテートヒドロラーゼドメイン含有タンパク質の発現、精製、結晶化、酵素アッセイ

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand its catalytic mechanism, allosteric behavior, and details of the enzymatic transformation of substrate to product in PLP-dependent enzymes. In this work, a novel expression system to produce the isolated &#945;- and isolated &#946;-subunit allowed the purification of high amounts of pure subunits and &#945;2&#946;2 StTS complex from the isolated subunits within 2 days. Purification was carried out by affinity chromatography followed by cleavage of the affinity tag, ammonium sulfate precipitation, and size exclusion chromatography (SEC). To better understand the role of key residues at the enzyme &#946;-site, site-direct mutagenesis was performed in prior structural studies. Another protocol was created to purify the wild type and mutant &#945;2&#946;2 StTS complexes. A simple, fast and efficient protocol using ammonium sulfate fractionation and SEC allowed purification of &#945;2&#946;2 StTS complex in a single day. Both purification protocols described in this work have considerable advantages when compared with previous protocols to purify the same complex using PEG 8000 and spermine to crystalize the &#945;2&#946;2 StTS complex along the purification protocol. Crystallization of wild type and some mutant forms occurs under slightly different conditions, impairing the purification of some mutants using PEG 8000 and spermine. To prepare crystals suitable for x-ray crystallographic studies several efforts were made to optimize crystallization, crystal quality and cryoprotection. The methods presented here should be generally applicable for purification of tryptophan synthase subunits and wild type and mutant &#945;2&#946;2 StTS complexes.

This article presents a series of consecutive methods for the expression and purification of Salmonella typhimurium tryptophan synthase comp this protocol a rapid system to purify the protein complex in a day. Covered methods are site-directed mutagenesis, protein expression in Escherichia coli, affinity chromatography, gel filtration chromatography, and crystallization.

PCR変異生成、クローニング、発現、高速タンパク質精製プロトコルおよびトリプトファン合成酵素の野生型および変異型の結晶化

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially abundant in the brain. Expressed primarily on the outer leaflet of the plasma membranes of cells, they modulate the activities of cell surface proteins via lateral association, act as receptors in cell-cell interactions and are targets for pathogens and toxins. Genetic dysregulation of ganglioside biosynthesis in humans results in severe congenital nervous system disorders. Because of their amphipathic nature, extraction, purification, and analysis of gangliosides require techniques that have been optimized by many investigators in the 80 years since their discovery. Here, we describe bench-level methods for the extraction, purification, and preliminary qualitative and quantitative analyses of major gangliosides from tissues and cells that can be completed in a few hours. We also describe methods for larger scale isolation and purification of major ganglioside species from brain. Together, these methods provide analytical and preparative scale access to this class of bioactive molecules.

Gangliosides are sialic acid-bearing glycosphingolipids that are particularly abundant in the brain. Their amphipathic nature requires organic/aqueous extraction and purification techniques to ensure optimal recovery and accurate analyses. This article provides overviews of analytic and preparative scale ganglioside extraction, purification, and thin layer chromatography analysis.

ガングリオシドの抽出、精製、プロファイリング

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...