この研究は、退役軍人事務所職業訓練賞1IK2BX001701、CTSA賞UL1TR000445、翻訳科学進歩センター、国立科学財団賞番号1547757および1400969、およびNIHグラントGM05551によって支持されました。その内容は、著者の責任であり、必ずしも移民科学振興機関または国立衛生研究所の公式見解を示すものではありません。

1.S100A12の発現<ol><li>コンピテントBL21 DE3細胞を、標準熱ショックプロトコール18を用いてpGEMEX-S100a12プラスミドで形質転換する。氷上の微量遠心管内で50μLの細菌に1〜5μLのプラスミドを添加する。 20分間インキュベートする。 </li><li>細胞を42℃で30秒間熱ショックする。 </li><li>細胞を氷上で2分間インキュベートする。 </li><li> 500μLのSOC培地を細胞に添加する。オービタルシェーカー上で250rpmで振とうしながら37℃で1時間インキュベートする。 </li><li> LB寒天培地（100μg/ mLアンピシリン添加）で150μLの形質転換反応をプレートする。 37℃で12〜16時間インキュベートする。 </li><li>一つのコロニーを選ぶ。 LB（100μg/ mLアンピシリンを補充）2mLを接種する。 </li><li>オービタルシェーカー（300 rpm）で37℃で4〜6時間インキュベートする。 OD 600は、1〜3の吸光度単位を読み取る必要があります。 </li><li> 50μLのZYM-5052 autoinduに500μLのスターター培養液を加えます100μg/ mLのアンピシリンを補充した培地で処理した。最良の通気と最大の発現のために、250mLのバッフル付き三角フラスコを使用してください。 37℃で24時間振とう（300rpm）。 </li><li>細菌懸濁液を遠心管に移す。 4℃で遠心分離（4,000×g、10分間）して細胞をペレット化する。 </li><li>培地をデカントし、サンプルを記録し、-80℃で細胞ペーストを保存する。サンプルは何年も安定しています。 </li></ol>低圧クロマトグラフィーを用いたS100A12の精製<ol><li> 30mLの20mMトリス、pH8.0中で細胞を再懸濁する。 </li><li>懸濁液を氷上で超音波処理して細胞を溶解する。 〜20W出力、5秒オン、5秒オフサイクルを5分間使用する。 </li><li>溶液を高速遠心管に移す。 4℃で30分間、20,000×gで遠心分離することにより、細胞溶解物を明確にする。 </li><li>上清を傾瀉し、清浄な100mLポリプロピレンビーカーに移す。ビーカーを氷上に置いて溶液を冷却する。攪拌棒を追加する11.20gの硫酸アンモニウムをゆっくり加える。溶液を氷上でさらに1時間撹拌する。これにより、硫酸アンモニウムの60％溶液が生成され、ほとんどの大腸菌内在性タンパク質が沈殿する。 S100A12は可溶性のままです。 </li><li>溶液を4℃、20,000 xgで20分間遠心分離し、沈殿したタンパク質をペレット化する。 </li><li>上清を捨て、透析チューブ（MWCO3,500 kDa）に移す。 4℃で1Lの20mM Tris（pH8.0）に対して透析する。透析バッファーを2回交換してください。変更の間に4時間を許可します。 </li><li> 陰イオン交換クロマトグラフィー <ol><li>低圧系でクロマトグラフィーを行う。典型的な流速は1mL /分である。 </li><li> 10mLの20mM Tris（pH8.0）で5mLセファロースカラムを平衡化する。 </li><li>サンプルポンプを使用して〜40 mLのS100A12溶液をロードします（フロースルーを収集します）。 </li><li> 10mLの20mM Tris（pH8）でカラムを洗浄する。 </li><li> 0〜30％の勾配でカラムを現像する（BuBカラムは19カラム容量（CV、95mL）で20mMトリス、pH8.0,1M NaClである。 5 mLの画分を集める。 </li><li>各画分の10μLアリコートをとり、MOM SDS PAGEを用いてクマシー染色で分析します。定電圧（20V / cm）で30分間ゲルを流します。 </li><li> S100A12を含むプール画分。 S100A12は、変性ゲル上で約10kDaタンパク質で作動する。 </li><li>限外濾過装置（MWCO 10kDa）を用いて画分を5mLに濃縮する。 3,000×gで約8分間遠心分離する。一番上の部分を取る。 </li></ol></li><li> サイズ排除クロマトグラフィー <ol><li> S75カラムを1 CV（120 mL）の20 mM Tris pH 8,100 mM NaClで平衡化する。 </li><li> 5mLの濃縮S100A12画分を（イオン交換クロマトグラフィーから）注入する。 </li><li>カラムを1 mL / mの流速で120 mL以上に展開する。 5 mLの画分を集める。 </li><li>各画分の10μLアリコートを取り、SDS PAGEを用いてクマシー染色を用いて分析する。タンパク質の同一性を確認するウェスタンブロットまたは質量分析（単量体サブユニット10,575.0Daの計算分子量、10575.4Daで測定）。 </li></ol></li><li> プール分 <ol><li>分光光度計を用いてプロテインA 280の吸光度を測定する。 SECバッファをブランクとして使用してください。 S100A12ホモ二量体の計算吸光係数は5960M -1 cm -1である 。 注：典型的な収量は50 mLの培養あたり35〜45 mgのS100A12です。 </li><li>アリコートS100A12を1.5 mLのマイクロ遠心チューブ（1 mg /チューブ）に入れ、液体窒素で急速凍結し、-80°Cで保存します。 </li></ol></li></ol> 3.抗菌活性アッセイ<ol><li> 5％ヒツジ血液（血液寒天プレート）を補充したトリプシン大豆寒天プレート上にG27株を播種する。 5％二酸化炭素を補充した室内空気中、37℃で2〜3日間増殖させる。 </li><li> 1×コレステロールを補充したBrucellaブロスにH.pyloriを接種する。文化的5％二酸化炭素を補充した室内空気中、37℃で一晩振とう（250rpm）。 </li><li> H.pylori 1:10を50％Brucella broth、50％calprotectin buffer + 1x cholesterolに希釈し、100μM塩化亜鉛プラス0,100,1,000μg/ mL精製S100A12を添加した培地で培養する。 5％二酸化炭素を補充した室内空気中、37℃で一晩振とう培養（250rpm）。 </li><li>翌日、連続希釈を行い、血液寒天プレート上にプレートする。細菌コロニーを5％二酸化炭素を補充した室内空気で37℃で2〜3日間生育させる。コロニー形成単位を列挙して、S100A12および/または外来性亜鉛の存在下または非存在下での細菌増殖を計算する。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益がないと宣言している。

ヒトS100A12の発現および精製の両方のための効率的なプロトコールが提示される。 E.coli発現系は、特にmg量が生化学的および生物物理学的研究のために必要とされる場合、組換えタンパク質の製造に使用される最も一般的なツールである。ここに記載されている手順の重要な強化は、標準的なルリアブロス培地18での発現と比較して、精製タンパク質の収率をほぼ30倍増加させる自動誘導培地26の使用である。さらに、自動誘導培地は、タンパク質発現ワークフローを大幅に簡素化します。従来の増殖培地を用いて、指数増殖期の間に誘導剤を添加できるように、培養物を連続的にモニターしなければならない。自動誘導メディアを使用している場合、倍増時間を監視する必要はありません。培養物を飽和まで増殖させる。自動誘導による成長の初期段階培地上では、大腸菌はグルコースを炭素源として使用する。グルコースが枯渇すると、バクテリアはタンパク質発現を誘導する炭素源としてラクトースに切り替わります26 。自己誘導培地の組成は、高密度培養の増殖を可能にするように、そして組換えタンパク質の発現を増加させるために、絶妙に調整される。 S100A12の我々の経験では、自己誘導培地は発現されるタンパク質の量を大幅に増加させるが、これはタンパク質依存性であり、実験的に検証されるべきであると我々は注意する。 S100A12は、大腸菌の細胞質画分に発現され、これは、それが可溶性であり、十分に折り畳まれていることを示唆している。精製の第一段階は、内因性大腸菌タンパク質の多くを沈殿させる硫酸アンモニウムを高割合で添加することを含む。この工程は、S100ファミリーのタンパク質の高い安定性および可溶性を利用する。 S100A12は適度に酸性であり（pI 5.81）。従って、S100A12は、強陰イオン交換樹脂でさらに精製される。精製プロセスの最後のステップは、S100A12が単分散および二量体であることを保証するサイズ排除クロマトグラフィーカラムである。このプロトコールのステップは、S100A12が可溶性オリゴマー15を形成することが示されており、オリゴマー化がその抗微生物活性に及ぼす影響には何も知られていないので、決定的に重要である。 S100クラスのメンバーは高い配列と構造上の相同性を共有しているので、それらの物理的性質は類似している27 。従って、S100A12のこの精製方法は、大腸菌の可溶性画分中で発現される全てのS100タンパク質に広く適用可能である。 これまでの研究では、カルプロテクチンなどのS100タンパク質はH.pyloriなどの細菌病原体に対して抗菌活性を示し、この活性は亜鉛結合活性に依存することが示されています25 。抗菌剤S100A12の活性はまた亜鉛依存性であるが、細菌増殖アッセイで示された増殖阻害は、カルプロテクチンのような他のS100ファミリータンパク質と比較して著しくより多くのS100A12が増殖阻害に必要であることを示している。したがって、類似の表現型（成長阻害またはビルレンスの変化）を達成するために、カルプロテクチンよりも高い濃度のS100A12を使用することが重要である。このプロトコールの将来の適用は、S100A12によって課せられた金属の隔離に応じた細菌の遺伝子発現、メタボローム、またはプロテオームの変化における全体的な変化を決定するために適用することができる。

S100タンパク質は、機能の多様な配列を有するカルシウム結合タンパク質のEFハンドファミリーのクラスである1 。それらは組織および細胞特異的様式で発現され、広範囲の細胞機能を調節する2,3 。カルシウム結合タンパク質に特有のS100タンパク質は、細胞内および細胞外の両方の機能を発揮します4,5 。細胞内では、Ca 2+結合は、タンパク質結合パートナー6を特異的に標的とする疎水性表面を露出する構造変化を誘導する。この細胞内機構は、細胞増殖、分化およびエネルギー代謝などの重要な過程を調節する。細胞外環境では、S100タンパク質は2つの機能を示す7 。 1つは、それらは損傷関連分子パターン（DAMP）タンパク質として作用し、炎症促進性サイトカインパターン認識受容体8,9 との相互作用による免疫性免疫応答。さらに、S100タンパク質クラスのいくつかのメンバーは、栄養免疫と呼ばれる過程で微生物病原体を飢餓にさせる働きをする転移金属を封鎖する10,11 。 S100A12（カルグラヌリンCおよびEN-RAGEとしても知られている）は、マクロファージおよび好中球において高度に発現され、炎症性疾患の潜在的なバイオマーカーとして同定されている12,13。そのEF-Hand部位でカルシウムを結合することに加えて、S100A12は、ダイマー界面14,15の反対側に位置する2つの高親和性遷移金属結合部位を有する。各結合部位は、3つのヒスチジン残基および1つのアスパラギン酸残基を含み、亜鉛または銅をキレートすることができるsup class = &quot;xref&quot;&gt; 16,17。最近、我々は、S100A12依存性亜鉛欠乏が、 ヘリコバクターピロリの成長および炎症誘発性病原因子の活性を調節する上で重要であることを報告した18 。 ピロリ菌は世界中の人口の約半分の胃に感染する。間違いなく最も成功した細菌病原菌の一つとなっている19 。 H.pyloriによる感染は、胃炎、消化性および十二指腸性潰瘍、粘膜関連リンパ組織（MALT）リンパ腫、および浸潤性胃腺癌（胃癌）を含む重大な胃疾患の転帰につながり得る。胃癌は、世界の非心臓癌関連死の主要な原因であり、胃癌の1つの最も大きな関連する危険因子は、 H.pyloriの感染である。 ヘリコバクターピロリはロブにもかかわらず胃のニッチに存続するこの細菌感染を制御する免疫機構のより良い理解の必要性を強調している20,21,22,23。 H.pylori関連炎症は、感染部位にS100A12を含む抗菌タンパク質のレパートリーを沈着させる多形核細胞または好中球の深い浸潤によって特徴付けられる18,24,25。宿主と病原体の複雑な対話を理解するために、我々はS100A12を精製し、この医学的に関連する病原体に及ぼす抗菌作用を研究する技術を改良しようとした。以下のプロトコルは、生物学的に活性な状態でのS100A12精製のための改良技術を概説する。高い親和性を有する栄養素を結合する能力それらを侵入する微生物からキレートする。さらに、以下の方法は、本来の抗菌分子が細菌病原体の増殖を制限する機構を研究するための重要な試薬として、このタンパク質の有用性を強調している。 S100Aファミリータンパク質は、免疫シグナル伝達および宿主防御に関与する先天性免疫系分子の重要なグループとして評価されてきた27 。これらの中で最もよく研​​究されているものは、カルプロテクチン（MRP-8/14、カルグラニュリンA / B、S100A8 / A9） 28,29,30 である。カルプロテクチンは、二量体界面31で遷移金属に結合するS100A8およびS100A9サブユニットのヘテロ二量体を形成する好中球関連タンパク質である。カルプロテクチンは、2つの金属結合部位を有することが示されている：部位1は、Zn 2+ 、Mn 2+ 、またはFe 2+に結合することができ、部位2は、<html> Zn 2+ 31,32に結合する。カルプロテクチンは、黄色ブドウ球菌 、 カンジダ・アルビカンス 、 アシネトバクター・バウマンニ 、 クレブシエラ・ニューモニエ 、 エシェリヒア・コリ 、およびヘリコバクター・ピロリを含む様々な病原体に対して抗菌活性を有すること、ならびにカルプロテクチンの金属キレート化活性に起因することが、 、 29 。 以前の研究は、カルプロテクチンが、外膜の脂質A構造の改変、（ ヘリコバクターピロリ中の主要な前炎症性ビルレンス因子である）カギIV型分泌系の抑制、バイオフィルム形成の誘発、および抑制を含むヘリコバクターピロリに対する多数の活性を発揮することを示したピロリ菌の増殖と生存率は用量依存的にclass = &quot;xref&quot;&gt; 25,33。さらに、遺伝的および生化学的アッセイにより、 ヘリコバクター・ピロリに対するカルプロテクチンの抗菌活性は、栄養素に結合する能力に大きく起因することが明らかになった25 。 ピロリ菌は、この病原体が増殖し増殖するための微量栄養素要求を確認するために化学的に規定された培地を利用した以前の研究によって決定されたように、亜鉛を必要とする34 。さらに、カルプロテクチンは、 H.pylori感染組織内に非常に豊富であり、好中球浸潤物と関連しており、感染およびその後の炎症の際の抗菌戦略として宿主がカルプロテクチンを使用する可能性があることを示しているバイアスプロテオミクススクリーニング技術からの最近の証拠は、反応性酸素種が豊富な条件下では、カルプロテクティブスズは、ヘキサ - ヒスチジン結合部位を変える翻訳後修飾を受け、それによってタンパク質36の金属結合活性を阻害する。このように、本発明者らは、これらの分子の広いレパートリーの中の他のS100Aファミリータンパク質が補助金属キレート化剤として潜在的に作用する可能性があると仮説した。我々は、上記の翻訳後修飾についてのスクリーニングで同定されておらず、亜鉛に結合する能力を有し、 H.pylori感染個体由来のヒト組織において非常に豊富であるため、さらなる研究のためにS100A12を選択した。 本発明者らの研究は、S100A12がH.pyloriの G27株において用量依存的にH.pyloriの増殖および生存を阻害し、このタンパク質の抗菌活性が過剰栄養素亜鉛の添加によって逆転され得ることを示している。この研究は、S100A12がPMSS1および7.1に対する抗菌活性を示した以前の研究を補完するH. pyloriの 3菌株であり、多数の臨床分離株および実験室で適応されたH.pylori菌株に対する広範な抗菌活性を示している18 。総合すると、これらの結果は、S100A12が栄養免疫による細菌の増殖と増殖を制御するメカニズムとして重要であることを確認しています。この重要な宿主 - 細菌相互作用の将来の研究には、宿主組織内の細菌負荷を低減するためのS100A12の活性を利用すること、またはH.pylori感染に関連して免疫シグナル伝達に対するこのタンパク質の寄与を決定することが含まれる。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;S100A12 Expression&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Expression cells&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BL 21 (DE3) competent cells</td><td>New England Biolabs</td><td>C25271</td><td></td></tr><tr><td>Autoinduction medium components</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>Research Products International</td><td>Y20020-250.0</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Research Products International</td><td>S23020-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Research Products International</td><td>T60060-250.0</td><td></td></tr><tr><td>FeCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2877</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Research Products International</td><td>M65240-100.0</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Research Products International</td><td>S23100-500.0</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Research Products International</td><td>P41200-500.0</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Research Products International</td><td>A20424-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Research Products International</td><td>S25150-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Research Products International</td><td>G22020-1.0</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Research Products International</td><td>G32040-500.0</td><td></td></tr><tr><td>lactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2643</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Selection agent&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ampicillin</td><td>Research Products International</td><td>A40040-5.0</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;S100A12 Purification&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKTA Start Chromatography System</td><td>GE</td><td>29-220-94</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Q Sepharaose Fast Flow</td><td>GE</td><td>17-5156-01</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep 16/60 S-200 HR</td><td>GE</td><td>17-1166-01</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop lite spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-LITE</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Research Products International</td><td>T60040-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;H. pylori &lt;/em&gt;Culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blood agar plates</td><td>Lab Supply Company</td><td>BBL221261</td><td></td></tr><tr><td>Brucella broth</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3051</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol (250x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12531018</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793566</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Zinc Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>229997</td><td></td></tr></tbody></table>

expression, purification, and antimicrobial activity of s100a12

カルグラニュリンタンパク質は先天性免疫の重要なメディエーターであり、カルシウム結合タンパク質のEFハンドファミリーのS100クラスのメンバーである。いくつかのS100タンパク質は、遷移金属を高親和性で結合し、「栄養免疫」と呼ばれる過程において、それらを侵入する微生物病原体から効果的に隔離する能力を有する。 S100A12（EN-RAGE）は亜鉛と銅の両方に結合し、マクロファージや好中球などの生来の免疫細胞に非常に豊富に存在します。本発明者らは、S100A12の活性金属結合構成における発現、濃縮および精製のための洗練された方法を報告する。このタンパク質の細菌増殖および生存度分析における利用は、S100A12が細菌病原体であるヘリコバクター・ピロリに対して抗菌活性を有することを示している。抗菌活性は、栄養素の亜鉛をキレート化するS100A12の亜鉛結合活性を前提としており、これにより、成長およびpに亜鉛を必要とするH.pyloriが飢えているロリファーション。

S100A12の発現および精製 3段階の精製により、50mLの細菌培養液から約40mgの組換えS100A12を産生した。第一段階は、内因性大腸菌（E.coli）タンパク質の硫酸アンモニウム沈殿であった 。この工程の後に、陰イオン交換クロマトグラフィー（ 図 1A ）を行った。タンパク質は、クーマシーブリリアントブルー（ 図1B ）で染色されたSDS-PAGEによって追跡されます。精製手順の最後のステップは、タンパク質を分子量および形状によって分離するサイズ排除クロマトグラフィー用のS100A12を含有する画分をプールすることを含んでいた（ 図2A ）。 S100A12はホモダイマー（サブユニットあたり92アミノ酸）であり、約21kDaの全分子量を有する。サイズ排除クロマトグラフィーから集めた画分をSDS-PAGEで分析し、クーマシー染色により可視化した（ 図2B </strong&gt;）。 S100A12は、亜鉛キレート活性を介して細菌増殖を抑制する S100A12の抗菌活性を調べるために、細菌生存率分析を定量的微生物培養技術によって行った（ 図3 ）。細菌細胞の計数は、S100A12を添加しない対照（P&gt; 0.05、一元配置ANOVA）と比較して、栄養亜鉛の外因性源の存在下または非存在下での100μg/ mLのS100A12への曝露は細菌生存性を有意に阻害しないことを明らかにする。しかし、培地単独で1000μg/ mLのS100A12に曝露すると、培地単独と比較して細菌生存率が69倍低下する（P = 0.0193、スチューデントt検定、P&gt; 0.05 One Way ANOVA）。外因性栄養素の添加により逆転された結果（P = 0.023、スチューデントt検定）。これらの結果はdeS100A12の抗菌活性は、その亜鉛隔離活性に依存する。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55557/55557fig1.jpg" /> 図1： 陰イオン交換クロマトグラフィーによる細胞溶解およびS100A12精製 。 （ a ）イオン交換精製のクロマトグラム。青色で示された280nmでのUV吸光度のトレース、ピンク色で示された塩勾配、赤色でマークされた分画。 （ b ）精製工程のSDS PAGEゲル。レーン：1）分子量標準2）可溶性ライセート画分3）硫酸アンモニウムペレット4）硫酸アンモニウム上清5-14）Qクロマトグラフィー画分6-15。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55557/55557fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src = &quot;/ files / ftp_upload / 55557 / 55557fig2.jpg&quot; /&gt; 図2：S100A12精製のサイズ排除クロマトグラフィーの結果。 （ a ）サイズ排除結果のクロマトグラム。青色で示された280nmでのUV吸光度のトレース、赤色でマークされた画分を集めた。 （ b ）サイズ排除クロマトグラフィーのSDS PAGEゲル。レーン：1）分子量マーカー2）試料負荷3-15）画分10-21。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55557/55557fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55557/55557fig3.jpg" /> 図3：S100A12依存性亜鉛キレートへの曝露に対する細菌生存度の定量的培養分析。細菌のみをS100A12の0,100、または100μg/ mLに培地単独（灰色の棒）で曝露したか、または100μMの塩化亜鉛を添加した培地（黒いバー）。外因性の栄養素源の不在下で1,000μg/ mLに曝露すると、細菌生存率の有意な阻害がもたらされる（* P &lt;0.05、中性+亜鉛条件と比較したスチューデントt検定）。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55557/55557fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>

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Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

ここでは、S100A12（calgranulin C）を発現、精製する方法を紹介します。我々は、ヒト病原体H.ピロリに対するその抗菌活性を測定するためのプロトコルを記載する。

S100A12の発現、精製および抗菌活性

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

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Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, as well as interactions with several growth factors and cytokines. Overexpression of specific MMPs is responsible in several diseases such as cancer, neurodegenerative diseases, and cardiovascular disease. MMPs have been the center of attention recently as targets to develop therapeutics that can treat diseases correlated to MMP overexpression.
To study the MMP mechanism in solution, more facile and robust recombinant protein expression and purification methods are needed for the production of active, soluble MMPs. However, the catalytic domain of most MMPs cannot be expressed in Escherichia coli (E. coli) in soluble form due to lack of posttranslational machinery, whereas mammalian expression systems are usually costly and have lower yields. MMP inclusion bodies must undergo the tedious and laborious process of extensive purification and refolding, significantly reducing the yield of MMPs in native conformation. This paper presents a protocol using Rosetta2(DE3)pLysS (hereafter referred to as R2DP) cells to produce matrix metalloproteinase-3 catalytic domain (MMP-3cd), which contains an N-terminal His-tag followed by pro-domain (Hisx6-pro-MMP-3cd) for use in affinity purification. R2DP cells enhance the expression of eukaryotic proteins through a chloramphenicol-resistant plasmid containing codons normally rare in bacterial expression systems. Compared to the traditional cell line of choice for recombinant protein expression, BL21(DE3), purification using this new strain improved the yield of purified Hisx6-pro-MMP-3cd. Upon activation and desalting, the pro domain is cleaved along with the N-terminal His-tag, providing active MMP-3cd for immediate use in countless in vitro applications. This method does not require expensive equipment or complex fusion proteins and describes rapid production of recombinant human MMPs in bacteria.

His-tag purification, dialysis, and activation are employed to increase yields of soluble, active matrix metalloproteinase-3 catalytic domain protein expression in bacteria. Protein fractions are analyzed via SDS-PAGE gels.

アフィニティークロマトグラフィーを用いたヒトマトリックスメタロプロテイナーゼ-3の細菌発現と精製

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, ...

生化学

A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors

Lysophospholipids (LPLs) are bioactive lipids that include sphingosine 1-phosphate (S1P), lysophosphatidic acid, etc. S1P, a metabolic product of sphingolipids in the cell membrane, is one of the best-characterized LPLs that regulates a variety of cellular physiological responses via signaling pathways mediated by sphingosine 1-phosphate receptors (S1PRs). This implicated that the S1P-S1PRs signaling system is a remarkable potential therapeutic target for disorders, including multiple sclerosis (MS), autoimmune disorders, cancer, inflammation, and even COVID-19. S1PRs, a small subset of the class A G-protein coupled receptor (GPCR) family, are composed of five subtypes: S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4, and S1PR5. The lack of detailed structural information, however, impedes the drug discovery targeting S1PRs. Here, we applied the cryo-electron microscopy method to solve the structure of the S1P-S1PRs complex, and elucidated the mechanism of activation, selective drug recognition, and G-protein coupling by using cell-based functional assays. Other lysophospholipid receptors (LPLRs) and GPCRs can also be studied using this strategy.

S1P exerts its diverse physiological effects through the S1P receptors (S1PRs) subfamily. Here, a pipeline is described to expound on the structures and function of S1PRs.

スフィンゴシン1-リン酸受容体の構造とシグナル伝達経路を調べるパイプライン

Lysophospholipids (LPLs) are bioactive lipids that include sphingosine 1-phosphate (S1P), lysophosphatidic acid, etc. S1P, a metabolic product of ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate immune system responses during the course of infection. Though methods have been developed to successfully purify and produce many of these important virulence factors, there are still many bacterial toxins whose unique structure or extensive post-translational modifications make them difficult to purify and study in in vitro systems. Furthermore, even when pure toxin can be obtained, there are many challenges associated with studying the specific effects of a toxin under relevant physiological conditions. Most in vitro cell culture models designed to assess the effects of secreted bacterial toxins on host cells involve incubating host cells with a one-time dose of toxin. Such methods poorly approximate what host cells actually experience during an infection, where toxin is continually produced by bacterial cells and allowed to accumulate gradually during the course of infection. This protocol describes the design of a permeable membrane insert-based bacterial infection system to study the effects of Streptolysin S, a potent toxin produced by Group A Streptococcus, on human epithelial keratinocytes. This system more closely mimics the natural physiological environment during an infection than methods where pure toxin or bacterial supernatants are directly applied to host cells. Importantly, this method also eliminates the bias of host responses that are due to direct contact between the bacteria and host cells. This system has been utilized to effectively assess the effects of Streptolysin S (SLS) on host membrane integrity, cellular viability, and cellular signaling responses. This technique can be readily applied to the study of other secreted virulence factors on a variety of mammalian host cell types to investigate the specific role of a secreted bacterial factor during the course of infection.

Here, a method using a permeable membrane insert-based infection system to study the effects of Streptolysin S, a secreted toxin produced by Group A Streptococcus, on keratinocytes is described. This system can be readily applied to the study of other secreted bacterial proteins on various host cell types during infection.

哺乳動物宿主細胞に分泌された細菌毒素の影響を研究するために、透過膜を挿入ベースの感染システムの実現

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

免疫・感染学

アフィニティークロマトグラフィーによる Sipunculus nudus からの線維素溶解酵素の精製

Affinity Purification of a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus

The fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus (sFE) is a novel fibrinolytic agent that can both activate plasminogen into plasmin and degrade fibrin directly, showing great advantages over traditional thrombolytic agents. However, due to the lack of structural information, all the purification programs for sFE are based on multistep chromatography purifications, which are too complicated and costly. Here, an affinity purification protocol of sFE is developed for the first time based on a crystal structure of sFE; it includes preparation of the crude sample and the lysine/arginine-agarose matrix affinity chromatography column, affinity purification, and characterization of the purified sFE. Following this protocol, a batch of sFE can be purified within 1 day. Moreover, the purity and activity of the purified sFE increases to 92% and&#160;19,200 U/mL,&#160;respectively. Thus, this is a simple, inexpensive, and efficient approach for sFE purification. The development of this protocol is of great significance for the further utilization of sFE and other similar agents.

著者スポットライト:Sipunculus nudus由来の線維素溶解酵素のアフィニティー精製  

Here, we present an affinity purification method of a fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus that is simple, inexpensive, and efficient.

シプンクルスヌーダスからの線維素溶解酵素の親和性精製

The fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus (sFE) is a novel fibrinolytic agent that can both activate plasminogen into plasmin and degrade fibrin ...

Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all variations are based on the 20 canonical amino acids (cAAs). As a way to introduce additional physicochemical properties into polypeptides, the incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) is increasingly used in protein engineering. Due to their relatively short length, the modification of ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides by ncAAs is particularly attractive. New functionalities and chemical handles can be generated by specific modifications of individual residues. The selective pressure incorporation (SPI) method utilizes auxotrophic host strains that are deprived of an essential amino acid in chemically defined growth media. Several structurally and chemically similar amino acid analogs can then be activated by the corresponding aminoacyl-tRNA synthetase and provide residue-specific cAA(s) &#8594; ncAA(s) substitutions in the target peptide or protein sequence. Although, in the context of the SPI method, ncAAs are also incorporated into the host proteome during the phase of recombinant gene expression, the majority of the cell&#39;s resources are assigned to the expression of the target gene. This enables efficient residue-specific incorporation of ncAAs often accompanied with high amounts of modified target. The presented work describes the in vivo incorporation of six proline analogs into the antimicrobial peptide nisin, a lantibiotic naturally produced by Lactococcus lactis. Antimicrobial properties of nisin can be changed and further expanded during its fermentation and expression in auxotrophic Escherichia coli strains in defined growth media. Thereby, the effects of residue-specific replacement of cAAs with ncAAs can deliver changes in antimicrobial activity and specificity. Antimicrobial activity assays and fluorescence microscopy are used to test the new nisin variants for growth inhibition of a Gram-positive Lactococcus lactis indicator strain. Mass spectroscopy is used to confirm ncAA incorporation in bioactive nisin variants.

The protocol presents the Escherichia coli-based selective pressure incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) into the lactococcal antimicrobial peptide nisin. Its properties can be changed during recombinant expression via substitution with desired ncAAs in defined growth media. Resulting changes in bioactivity are mapped by growth inhibition assays and fluorescence microscopy.

非正規のアミノ酸類の選択的な圧力の取り込みによって生成される抗菌ペプチド

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all ...

生物工学

Purification of Human S100A12 and Its Ion-induced Oligomers for Immune Cell Stimulation

In this protocol, we describe a method to purify human calcium-binding protein S100A12 and its ion-induced oligomers from Escherichia coli culture for immune cell stimulations. This protocol is based on a two-step chromatography strategy, which comprises protein pre-purification on an anion-exchange chromatography column and a subsequent polishing step on a hydrophobic-interaction column. This strategy produces S100A12 protein of high purity and yield at manageable costs. For functional assays on immune cells eventual remnant endotoxin contamination requires careful monitoring and further cleaning steps to obtain endotoxin-free protein. The majority of endotoxin contaminations can be excluded by anion-exchange chromatography. To deplete residual contaminations, this protocol describes a removal step with centrifugal filters. Depending on the available ion-strength S100A12 can arrange into different homomultimers. To investigate the relationship between structure and function, this protocol further describes ion-treatment of S100A12 protein followed by chemical crosslinking to stabilize S100A12 oligomers and their subsequent separation by size-exclusion chromatography. Finally, we describe a cell-based assay that confirms the biological activity of the purified protein and confirms LPS-free preparation.

This protocol describes a purification method for recombinant tag-free calcium binding protein S100A12 and its ion-induced oligomers for human monocyte stimulation assays.

免疫細胞刺激のためのヒトS100A12とそのイオン誘発オリゴマーの精製

In this protocol, we describe a method to purify human calcium-binding protein S100A12 and its ion-induced oligomers from Escherichia coli culture for ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

機能の研究、相互作用、および翻訳後修飾のため出芽酵母タンパク質の抽出と精製

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

生物学

Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization

The use of confocal microscopy as a method to assess peptide localization patterns within bacteria is commonly inhibited by the resolution limits of conventional light microscopes. As the resolution for a given microscope cannot be easily enhanced, we present protocols to transform the small rod-shaped gram-negative Escherichia coli (E. coli) and gram-positive Bacillus megaterium (B. megaterium) into larger, easily imaged spherical forms called spheroplasts or protoplasts. This transformation allows observers to rapidly and clearly determine whether peptides lodge themselves into the bacterial membrane (i.e., membrane localizing) or cross the membrane to enter the cell (i.e., translocating). With this approach, we also present a systematic method to characterize peptides as membrane localizing or translocating. While this method can be used for a variety of membrane-active peptides and bacterial strains, we demonstrate the utility of this protocol by observing the interaction of Buforin II P11A (BF2 P11A), an antimicrobial peptide (AMP), with E. coli spheroplasts and B. megaterium protoplasts.

Here we present a protocol to produce gram-negative Escherichia coli (E. coli) spheroplasts and gram-positive Bacillus megaterium (B. megaterium) protoplasts to clearly visualize and rapidly characterize peptide-bacteria interactions. This provides a systematic method to define membrane localizing and translocating peptides.

生産と細菌のスフェロプ ラストとプロトプ ラスト抗菌ペプチドの局在を特徴付けるための可視化

The use of confocal microscopy as a method to assess peptide localization patterns within bacteria is commonly inhibited by the resolution limits of ...

S100A12の発現、精製および抗菌活性

要約

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アフィニティークロマトグラフィーを用いたヒトマトリックスメタロプロテイナーゼ-3の細菌発現と精製

スフィンゴシン1-リン酸受容体の構造とシグナル伝達経路を調べるパイプライン

哺乳動物宿主細胞に分泌された細菌毒素の影響を研究するために、透過膜を挿入ベースの感染システムの実現

シプンクルスヌーダスからの線維素溶解酵素の親和性精製

シプンクルスヌーダスからの線維素溶解酵素の親和性精製

シプンクルスヌーダスからの線維素溶解酵素の親和性精製

非正規のアミノ酸類の選択的な圧力の取り込みによって生成される抗菌ペプチド

免疫細胞刺激のためのヒトS100A12とそのイオン誘発オリゴマーの精製

機能の研究、相互作用、および翻訳後修飾のため出芽酵母タンパク質の抽出と精製

生産と細菌のスフェロプラストとプロトプラスト抗菌ペプチドの局在を特徴付けるための可視化

S100A12の発現、精製および抗菌活性

要約

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アフィニティークロマトグラフィーを用いたヒトマトリックスメタロプロテイナーゼ-3の細菌発現と精製

スフィンゴシン1-リン酸受容体の構造とシグナル伝達経路を調べるパイプライン

哺乳動物宿主細胞に分泌された細菌毒素の影響を研究するために、透過膜を挿入ベースの感染システムの実現

シプンクルスヌーダスからの線維素溶解酵素の親和性精製

シプンクルスヌーダスからの線維素溶解酵素の親和性精製

シプンクルスヌーダスからの線維素溶解酵素の親和性精製

非正規のアミノ酸類の選択的な圧力の取り込みによって生成される抗菌ペプチド

免疫細胞刺激のためのヒトS100A12とそのイオン誘発オリゴマーの精製

機能の研究、相互作用、および翻訳後修飾のため出芽酵母タンパク質の抽出と精製

生産と細菌のスフェロプ ラストとプロトプ ラスト抗菌ペプチドの局在を特徴付けるための可視化

生産と細菌のスフェロプラストとプロトプラスト抗菌ペプチドの局在を特徴付けるための可視化