迅速な注射法による脂質被覆ナノ粒子の製造は、癌治療のための安定した薬物送達システムを提供する。この技術は、疎水性薬物をカプセル化するナノ粒子製造のためのシンプルで高速でスケーラブルで再現可能な技術です。この技術は、いくつかの疾患条件で有効に使用することができる水化材料からの診断および治療用ナノ粒子を製造するために適用可能である。
この製造技術は、DLSとともに、脂質、タンパク質、ポリマーなどの疎水性物質の核化および成長を研究するために使用することができる。ナノ粒子を作製する前に、薬物物質の物理的な化学的性質を知ることは重要です。また、必ず正しい濃度のコーティング脂質を使用してください。
この方法の視覚的なデモンストレーションは、製造技術のシンプルさを示し、ナノ粒子としての薬物の細胞への正常な送達を示すために重要である。クロロホルムやホルムアルデヒドを使用する場合は注意が必要であり、ヒュームフードの下で作業する必要があります。まず、2.4ミリリットルの250マイクロモルファルカリンジオールストック溶液をシンチレーションバイアルに70%エタノールに溶解します。
サンプル濃縮器を使用して、液体分画を約4時間蒸発させて乾燥ファルカリンジオールを得る。サンプル濃縮器を使用して、試料を室温で通し、サンプルを濃縮します。乾燥したら、ここに示す成分をヒュームフードのシンチレーションバイアルに加え、クロスコンタミネーションを避けるために各成分を添加した後、クロロホルムでシリンジを洗浄してください。
次に、すぐに溶媒が蒸発しないように脂質を含むバイアルを閉じ、それによって濃度を変更します。光からDiIを保護するためにアルミホイルでバイアルを包み、クロロホルムを蒸発させるためにデシケータに一晩サンプルを残します。翌日、乾燥したサンプルを絶対エタノールに溶解し、最終体積は1.2ミリリットルにする。
この溶液は有機相を表す。12ミリリットルのガラスバイアルを取り、精製水の9ミリリットルでそれを埋めます。その後、9ミリリットルの水を含むバイアルに磁気ノミを加えます。
バイアルを磁気スターラーに置き、500 rpmでかき混ぜます。次に、1ミリリットルのガラス注射器を分配システムに取り付け、クロロホルムをガラス注射器の中に少なくとも10回ゆっくりと引き出します。クロロホルムを毎回廃棄物コレクタに分配します。
クロロホルムで注射器を洗浄することで、汚染を防ぐことができます。今度は注射器にエタノールを盛り付けろ。プライミングは、古い溶媒を置き換えるだけでなく、任意の気泡を除去します。
注射器を使用して、有機相の1ミリリットルを吸引し、9ミリリットルのウォーターマークの真ん中までガラスバイアルに注射器を挿入する。バイアルの中央で安定して維持し、分配システムの分配ボタンを押すことによって毎秒833マイクロリットルで溶液を注入する。これは、10%エタノールでファルカリンジオールの50マイクロモル脂質被覆ナノ粒子の10マイクロモルの10マイクロリットルを生成する。
この注入速度は、狭い粒度分布を有する最も優れたナノ粒子を達成することが分かった。注射中に、針が安定してまっすぐに中央に挿入されていることを確認することが重要です。注射の直後に、攪拌機からバイアルを取り出し、サンプルを50ミリリットルの丸い底フラスコに移します。
フラスコをロータリーエバポレーターに攻撃し、室温で有機溶媒を1ミリリットル蒸発させる。過剰なバブル形成を避けるために注意してください。ナノ粒子懸濁液をフラスコから別の12ミリリットルガラスバイアルに移します。
ボリュームが9ミリリットルであることを確認し、2つの12ミリリットルガラスバイアルにサンプルを分割します。その後、バイアルの1つに0.5ミリリットルの超純水を加え、もう10倍のリン酸緩衝生理食塩水を他のバイアルに0.5ミリリットル加えます。デジタル光散乱器をオンにし、安定するまで温度を摂氏20度に設定します。
次に、次に示すように計測器のパラメータを設定します。プラスチックキュベットにナノ粒子懸濁液を1ミリリットル充填し、測定を開始します。使用した溶媒に応じて測定サイズを報告する。
種子は滅菌1.5カバースリップに約50,000個の細胞を6ウェルプレートに入れ、約30%の細胞密度を得るために、各ウェルに3ミリリットルの最終体積を有するために培地を添加する。標準的な培養条件下で24時間培養します。翌日、ナノ粒子溶液の3マイクロリットルを加えて、最終的なファルカリンジオール濃度の5マイクロモルを加える。
その後、細胞を24時間培養器に戻す。24時間処理した後、PBSで細胞を2回洗浄し、室温で10分間4%ホルムアルデヒドに固定します。固定後、0.1%トリトンX-100で細胞を30分間透過させる。
その後、PBSで2回洗浄し、光から保護された300ナノモルDAPIの250マイクロリットルで5分間染色します。PBS を使用して、スライドにカバー スリップを置きます。150x主観に回し、電子乗算CCDカメラを搭載した広視野蛍光顕微鏡のステージにスライドを移します。
GFP-LP チャネルを使用した画像セル。さらに、数値開口1.4の63x油目的を使用して共焦点顕微鏡画像を撮影することにより、ナノ粒子の細胞への取り込み検証を行います。画像DiIは、514ナノメートルのアルゴンレーザーと780ナノメートルの2光子レーザーを用いたDAPIを使用した。
水中で形成され、PBSで測定されたファルカリンジオールの未コーティングナノ粒子は、PD指数0.571で高い多分散性を示した。この値は、粒子サイズの広い分布と不均一な分布を示します。これに対し、本ビデオで作製したファルカリンジオールの脂質被覆ナノ粒子は、0.182の多分散指数を有する74.1ナノメートルであり、粒度の比較的単分散および均一な分布を示した。
細胞内のナノ粒子の最初の観察として、24時間の治療後に蛍光顕微鏡画像が取得された。ナノ粒子は白色の明るい点として視覚化され、核を取り巻く細胞の中にナノ粒子が位置していると仮定することができます。ファルカリンジオールナノ粒子が細胞に入ったことを確認するために、細胞上でも共焦点顕微鏡を行った。
ここには多数のナノ粒子が示され、細胞質中に全ての細胞に散在する。これらの結果は、ナノ粒子がファルカリンジオールの安定した薬物送達システムとして機能することを示している。この手順を試みている間、適切な混合を確実にするために、正しい注入速度で溶液を注入し、シードを安定させ、中央に保つことが重要です。
この手順は、治療用ナノ粒子を処方する任意の疎水性薬物または癌などの様々な疾患条件で使用することができる診断ナノ粒子を製剤化するためのイメージング剤に使用することができる。この技術により、ナノ粒子が細胞に取り込まれるメカニズムや、生細胞イメージングや薬物の抗癌効果の研究に関する研究が可能になりました。
