この作品は、医学のNHMRCプログラムグラント＃568969（PSS）と学部、ニューサウスウェールズ大学、幹細胞イニシアティブ（KSS）によってサポートされています。

以下の手順のすべてがクラスIIバイオセーフティキャビネット内無菌技術を使用して行われている。使用する試薬や機器は、以下の表に記載されています。 1。 1.1％アルギン酸（w / v）の準備<ol><li>滅菌した50mlのチューブにアルギン酸ナトリウム（高グルクロン酸含有量≥60％、粘度&gt; 200メガパスカル秒、エンドトキシン≤100 EU / g）を精製した0.275グラムを追加し、25 mlの滅菌0.1パーセントゼラチン溶液、事前に準備を追加（0.5グラムgelatin/500ミリリットルミリ-Q H 2 O、オートクレーブで溶解したもの）。 </li><li>部分的にアルギン酸塩粉末を溶解するのに約30秒間ボルテックスチューブは一晩、10×gで軌道ミキサー上にチューブを置きます（室温）。 </li><li>アルギン酸塩溶液25mlの9％滅菌食塩（NaCl/50ミリリットルミリ-Q H 2 O 4.5 g）の2.778ミリリットルを追加します。 5分95×gで遠心分離し、続いて約30秒間ボルテックスチューブを。 </li><li> 4でアルギン酸塩溶液を保存°、短期記憶（1-2ヶ月）または-20℃で長期保管（年程度）のC。 </li></ol> 2。 CaCl 2を析出槽の準備<ol><li>ミリ-Q H 2 Oの1リットルのCaCl 2の14.7グラム。2H 2 OとHEPESの2.38グラムを溶かす</li><li> 7.4のpHレベルを調整します。 </li><li> 0.22μmのフィルターを使用してソリューションを殺菌する。 </li><li>沈殿槽は室温（6-12ヶ月）で保存することができます。 </li></ol> 3。カプセル化解除溶液の調製<ol><li>ダルベッコのリン酸500mlに生理食塩水（D-PBS）をバッファ、0.5M EDTA 50mlと1M HEPES、5 mlを加える。 </li><li> 20分間121℃0.22μmのフィルターまたはオートクレーブ°Cを使用して滅菌する。 </li><li>室温（6-12ヶ月）でカプセル化解除ソリューションを保存します。 </li></ol> 4。血清代替物（SR）培地の調製<ol><li>前のカプセル化には、DEのように事前にSR培地を調製特定の試薬や機器の表にスクライブ。 </li></ol> 5。 ROCK阻害剤の調製（Y-27632） <ol><li>ヒトD-PBSで（HSA）血清アルブミン5 mM溶液を作るため0.1％Y-27632の粉末を希釈する。 </li></ol> 6。カプセル化のためのhESCの準備<ol><li> 37°C（光から保護）で2時間ROCK阻害剤（RI）の10μMを添加した培養培地で細胞を事前に扱います。 </li><li> RI処理後、37℃で10分間accutaseで酵素的に二回D-PBSで細胞を洗浄し、培養プレートから細胞を除去する</li><li>静かにピペットやセルスクレーパーで細胞をこすり、15 mlチューブに収集されます。 1:1の比率でSR培地でaccutaseを中和する。 </li><li>単一細胞懸濁液を調製し、40μmのフィルターを用いて中和し、細胞をフィルタリングし、新鮮な50 mlの遠心チューブに集める。 </li><li>血球計を使用して、ソリューション内のセルの合計数を計算します。 </LI&gt; <li> 5分間細胞懸濁液を95×gで遠心し、慎重に、その後上清を捨てる。予め温めておいた0.9％のNaClで細胞を洗浄します。 5分95×gで遠心し、上清を捨てる。 </li></ol> 7。細胞のカプセル化<ol><li> 14G×2 &quot;IVカテーテルの軟質プラスチックチューブに取り付けられた1 mlの注射器を準備します。これは、図1に示すように、シリンジポンプにロードされて細胞懸濁液を吸引するために使用されます。 </li><li> 125万細胞/ mlアルギン酸塩の密度で予め温めておいたアルギン酸塩溶液で細胞を再懸濁します。静かに注射器で混ぜて泡を作成することは避けてください。 </li><li>図1に示すように、ビーズジェネレータ、シリンジポンプとエアフローメータを設定します。これらのデバイスの詳細については、特定の試薬や機器の表に記載されています。 </li><li>シリンジに吸引し、細胞と、IVカテーテルのプラスチックチューブを廃棄し、カプセルマシンにシリンジを接続します。 10 cmの隙間ががあることを確認してください<html>図1に示すように、カプセル化マシンとコレクションポイントの終了をトゥイーンする。 </li><li> 20ミリリットル/時間、8 L / minで、100 kPaの（カプセルのサイズは空気の流量を変えることによって変更することができます）の圧力の空気流量でシリンジポンプを設定することにより、細胞をカプセル化します。 </li><li>カプセルを安定させるための7分間予め温めておいた沈殿槽の20mlを充填したペトリ皿（100×15ミリメートル）にカプセル化された細胞を収集します。 </li><li>の0.9％NaCl 20mlを充填し50 mlの遠心チューブに穏やかな吸引によってカプセル化されたセルを転送します。 </li><li>ゆっくり、上清を捨てるカプセルがチューブの底に沈殿することができます。の0.9％NaClで洗浄プロセスを繰り返します。 </li><li>培養フラスコにRI（10μM）、転送を補充し、37℃/ 5％CO 2でインキュベート予め温めておいた培養培地中にカプセル化された細胞を再懸濁します。 </li></ol> 8。 DAニューロンにカプセル化されたhESCの分化ve_content &quot;&gt;カプセル化されたhESCが分化する前に3日間のRIで処理される。 <ol><li>シードマウス間質細胞株、0.1％ゼラチンコートT75フラスコおよび条件24時間の分化前にDA神経分化培地中のPA6細胞（材料表）で1.0×1cm 2当たり10 4の密度でPA6細胞。 </li><li> 50 mlの遠心管にカプセルを転送し、それらがチューブの底に沈殿することができます。 </li><li>上清を捨て、PA6細胞エアコンDA神経分化培地中でカプセルを懸濁します。 </li><li>その後4日目のメディアの変化と隔日で28日間培養PA6細胞単層（7.5×10 5 PA6細胞あたり9×10 6ヒトES細胞）とカプセル化のhESC（各時間は培地の半分だけを変更します）。 </li><li> PA6細胞と培養中の3週間後、残りの週に100 ng / mlのSHHおよび100 ng / mlのFGF8aでDA神経分化培地を補足するものです。 </LI&gt; </ol> 9。カプセル化されたhESCのカプセル化解除<ol><li> 15 mlの遠心管にカプセルを吸引し、それらをチューブの底に沈殿することができます。その後、慎重に上清を捨てる。 </li><li>二回D-PBSでカプセルを洗浄します。その後、上清を除去するカプセルがチューブの底に沈殿しましょう​​。 </li><li>カプセルへの解決策をdecapsulating 5ミリリットルを追加します。 4から5分間室温でインキュベーションする前に吸引を介して完全に懸濁液を混ぜる。 </li><li> 3分95 xgでカプセル化が解除された細胞を遠心し、上清を捨てる。 </li><li> 3分95×gで遠心分離し、続いてD-PBSで細胞ペレットを洗浄します。繰り返します。 </li><li>カプセル化が解除された細胞はさらに、単層として培養されたまたは下流の分析に使用することができます。 </li></ol> 10。代表的な結果アルギン酸マイクロカプセルの直径は400から500μmである。カプセル内の細胞の数はestimatでした一回のカプセルの総数で割った細胞の総数を計算することによってED。したがって、カプセル当たり約5.0×10 4個の細胞を推定した。このことから、我々はカプセルに含めることができるセルの最大数は、約1.0×10 5であることを想定しています。カプセル化されたhESCの生存率はカルボキシフルオレセインジアセテートsuccinimidlyエステル（CFDA）/ヨウ化プロピジウム（PI）アッセイを用いて使用することにより決定&gt; 80％（図2）のとおりです。我々は1.1％に2.2％からアルギン酸塩濃度を減少させることによってと塩化バリウムの塩化カルシウムを沈殿槽を変更することにより、hESCのカプセル化の条件を最適化しました。これらの条件から、我々は1.1％アルギン酸カルシウムでカプセル化された細胞のみが生き残ることができることを示した、増殖し、in vitroで 1 に EBを形成しています。さらに条件を最適化するために、培養媒体とRIの効果は、Y-27632を調べた。図2および3に示すように、データは、RIのpreventeを実証D解離誘導アポトーシスと細胞の生存と昇格クラスター形成1,6を維持した 。さらに、HFF-CM + RIで培養したカプセル化されたhESCの生存率は、RIの補充せずに他のグループよりも有意に高かった。しかしながら、これはSR + RIで培養されたカプセル化されたhESCに有意差はなかった。同様に、BrdUアッセイを使用して、細胞増殖は、クラスタ（図3）へと発展して、単一の細胞として25％から75％に増加した。 TUNELによるアポトーシスアッセイは、HFF-CMから取得したクラスタでは、TUNELのために主に陰性であったのに対し、SR培地で培養したマイクロカプセル内の単一の細胞（データは示さず）アポトーシスであることを明らかにした。ある程度までは、bFGFを添加したHFF-CMには、Y-27632が存在しない場合にカプセル化されたヒトES細胞の生存と増殖を促進した。しかし、Y-27632による治療カプセル化の前に（2時間）と後（追加の4日間）が著しく強化された生存率、増殖およびカプセル化されたhESCのクラスター形成1.1％アルギン酸カルシウムマイクロカプセルインチ以前に我々は、カプセル化されたhESCのが正常胚体内胚葉1に分化させることができることを実証した。ここでは、DAニューロンにカプセル化されたのhESCを区別するために、3Dのプラットフォームとして、細胞カプセル化の応用を検討した。カプセル中の胚様体（EB）が分化した直接的、記載の条件下でカプセル化解除に形成されたhESCのは、90％以上の生存率との文化の2-3日後に進行性の神経細胞の形態（図4）を示した。 neuroprogenitorマーカー、PAX6およびDA神経マーカー、THは、分化の7日間（図5A）の後にアップレギュレートされている間の遺伝子発現解析では、多能性マーカーのダウンレギュレーション、OCT4を示した。免疫蛍光染色は、分化したhESCは、7日目にPAX6陽性（&gt; 80％）が、OCT4陰性であったことを明らかにした。さらに分化hESCの21日後のTH陽性（&gt; 90％）ニューロン（図5B）を示した。ウェスタンブロット解析でも示された14日からTH発現のアップレギュレーション（図5C）PAX6発現は、21日後のダウンレギュレーションであった。比較では、同様の条件下で2次元（2D）の環境下で培養した細胞（例えば、前の分化〜3日2時間RI後処理のためにRIの前処理）PAX6陽性細胞（の割合が高いの&gt; 80を維持して％）、分化期間中およびカプセル化（図5AおよびC）が提供する3D環境のようにTH陽性細胞（&lt;60％）に分化のように効率的ではありませんでした。

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	<li>Chayosumrit, M., Tuch, B., Sidhu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+microcapsule+for+propagation+and+directed+differentiation+of+hESCs+to+definitive+endoderm.">Alginate microcapsule for propagation and directed differentiation of hESCs to definitive endoderm.</a> Biomaterials. 31, 505-514 (2010).</li><li>Dean, S. K., Yulyana, Y., Williams, G., Sidhu, K. S., Tuch, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+encapsulated+embryonic+stem+cells+after+transplantation.">Differentiation of encapsulated embryonic stem cells after transplantation.</a> Transplantation. 82, 1175-1184 (2006).</li><li>Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+benefit+of+human+embryonic+stem+cell+encapsulation+for+prolonged+feeder-free+maintenance.">The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance.</a> Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).</li><li>Dawson, E., Mapili, G., Erickson, K., Taqvi, S., Roy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials+for+stem+cell+differentiation.">Biomaterials for stem cell differentiation.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 60, 215-228 (2008).</li><li>Orive, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+encapsulation:+promise+and+progress.">Cell encapsulation: promise and progress.</a> Nat. Med. 9, 104-107 (2003).</li><li>Watanabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li><li>Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled,+scalable+embryonic+stem+cell+differentiation+culture.">Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture.</a> Stem Cells. 22, 275-282 (2004).</li><li>Drukker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+expression+of+MHC+proteins+in+human+embryonic+stem+cells.">Characterization of the expression of MHC proteins in human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99, 9864-9869 (2002).</li><li>Calafiore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+Technical+Procedures+for+Microencapsulation+of+Human+Islets+for+Graft+into+Nonimmunosuppressed+Patients+With+Type+1+Diabetes+Mellitus.">Standard Technical Procedures for Microencapsulation of Human Islets for Graft into Nonimmunosuppressed Patients With Type 1 Diabetes Mellitus.</a> Transplantation Proceedings. 38, 1156-1157 (2006).</li><li>Cho, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+and+large-scale+generation+of+functional+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3392-3397 (2008).</li><li>Vazin, T., Chen, J., Lee, C. T., Amable, R., Freed, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+stromal-derived+inducing+activity+in+the+generation+of+dopaminergic+neurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Assessment of stromal-derived inducing activity in the generation of dopaminergic neurons from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 26, 1517-1525 (2008).</li></ol>

我々は、開示することは何もありません。

マウス胚性幹細胞とのhESCを使用して、いくつかの研究は、生体材料と組織工学2,3の3D培養システムの利点を実証した。我々は、アルギン酸バリウムよりもアルギン酸カルシウムでカプセル化されたときのhESCが有意に高い生存率を示したので、アルギン酸バリウムと比較してhESCの増殖と分化を研究するのに適した3Dプラットフォームとしてアルギン酸カルシウムマイクロカプセルを使?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>アルギン酸塩（MVG UP Pronova） </td><td> NovoMatrix </td><td> 4200101 </td><td>高いグルクロン酸含有量≥60％、粘度&gt; 200メガパスカル秒、エンドトキシン&lt;100 EU / gで</td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> G1890-100G </td><td></td></tr><tr><td> 0.9％のNaCl </td><td>バクスターヘルスケア</td><td> AHF7123 </td><td></td></tr><tr><td>タイプJ1ビーズジェネレータ</td><td> Niscoエンジニアリング株式会社</td><td> SPA-0447 </td><td></td></tr><tr><td>マルチフェイザーシリンジポンプ</td><td>新時代のポンプシステム株式会社</td><td>モデルNE-1000 </td><td></td></tr><tr><td> EZIフロー医療計</td><td>ガスコーニュ語システム</td><td> G0149 </td><td></td></tr><tr><td> Y-27632 </td><td>メルク</td><td> 688000 </td><td></td></tr><tr><td>ヒト血清アルブミン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> A4327-1G </td><td></td></tr><tr><td> Accutase </td><td>ミリポア</td><td> SCR005 </td><td></td></tr><tr><td> 14G×2 &quot;IVカテーテル</td><td>テルモ</td><td> SR-OX1451C </td><td></td></tr><tr><td>ノックアウト-DMEM </td><td>インビトロジェン</td><td> 10829-018 </td><td> SR培地（基礎）の</td></tr><tr><td>グルタミン-I </td><td>インビトロジェン</td><td> 35050-061 </td><td> SR培地（2 mM）を用</td></tr><tr><td>ノックアウト血清代替物</td><td>インビトロジェン</td><td> 10828-028 </td><td> SR培地（20％）の</td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン</td><td>インビトロジェン</td><td> 15070063 </td><td> SR培地（2.5 U / ml）を用</td&gt; </tr><tr><td>インスリン - トランスフェリン - セレン（ITS） </td><td>インビトロジェン</td><td> 41400045 </td><td> SR培地（1x）を用</td></tr><tr><td> β-メルカプトエタノール</td><td>インビトロジェン</td><td> 21985-023 </td><td> SR培地（0.1 mm）の</td></tr><tr><td> MEM NEAAソリューション</td><td>インビトロジェン</td><td> 11140-050 </td><td> SR培地（5mM）を用</td></tr><tr><td>グラスゴー最小必須培地</td><td>インビトロジェン</td><td> 11710035 </td><td> DA神経分化培地（基礎）の</td></tr><tr><td>ノックアウト血清代替物</td><td>インビトロジェン</td><td> 10828-028 </td><td> DA神経分化培地（10％） </td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>インビトロジェン</td><td> 11360070 </td><td> DA神経分化培地（1mM）を用</td></tr><tr><td> MEM NEAAソリューション</td><td>インビトロジェン</td><td> 11140-050 </td><td> DA nのeural分化培地（0.1 mM）を</td></tr><tr><td> β-メルカプトエタノール</td><td>インビトロジェン</td><td> 21985-023 </td><td> DA神経分化培地（0.1 mm）の</td></tr><tr><td>ソニックヘッジホッグ（SHH） </td><td> R＆Dシステムズ</td><td> 1314-SH-025/CF </td><td> DA神経分化（100 ng / ml）を用</td></tr><tr><td>線維芽細胞増殖因子8A（FGF8a） </td><td> R＆Dシステムズ</td><td> 4745-F8-050 </td><td> DA神経分化（100 ng / ml）を用</td></tr></tbody></table>

alginate microcapsule as a 3d platform for propagation and differentiation of human embryonic stem cells (hesc) to different lineages

彼らは無限に培養で増殖し、身体の任意のセルのタイプに区別することができますので、ヒト胚性幹細胞（hESCの）は、細胞補充療法のための魅力的な代替供給源として浮上している。生体の様々なタイプも幹細胞のニッチ1-3模倣 ​​微小環境を提供するために、幹細胞培養に使用されている。後者は、カプセル化などの3次元（3D）環境4を提供することにより、特定の系統だけでなく、組織の組織に細胞間相互作用、細胞増殖、分化を促進するために重要である。細胞のカプセル化の原理は、3D文化2で半透膜の範囲内で生きている細胞の捕捉が含まれます。カプセルの孔径よりも大きくなり、ホストからの抗体および免疫細胞は、5除外されているのに対し、これらの膜は、膜を横切って栄養素、酸素と刺激の交換を可能にします。ここでは、事前に文化へのアプローチを送り、アルギン酸マイクロカプセルを用いた3次元微小でhESCのDAニューロンを区別します。我々は、カプセル化されたhESCの生存率を向上させる培養条件2を変更しました。我々はこれまでに大幅にカプセル化されたhESCの生存率を高め、3DプラットフォームP160-Rhoの関連コイルドコイルキナーゼ（ROCK）阻害剤、Y-27632およびヒト胎児線維芽細胞エアコン血清代替培地（HFF-CM）を加えていることが示されているている細胞は胚体内胚葉マーカー遺伝子1を表明した。我々は今、DAニューロンへのhESCと効率的な分化の伝播のために、この3Dプラットフォームを使用している。タンパク質および遺伝子発現解析は、DA神経分化の最終段階の後にチロシン水酸化酵素の発現の増加（TH）、DAニューロンのマーカーで、2週間後&gt; 100倍を示した。我々は、アルギン酸マイクロカプセルを使用して、我々の3Dプラットフォームは増殖を研究するために有用であるという仮説を立てたとの差別化を指示様々な系統にhESCの。この3Dシステムでは、分化の過程でのhESCからフィーダー細胞を分離することができ、また、将来的には移植時の免疫単離するための可能性を秘めています。

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Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

我々は、内胚葉とドーパミン（DA）ニューロンへの伝播および胚性幹細胞の分化のための効果的な3Dプラットフォームとしてマイクロカプセル化技術を最適化しました。また、移植時にホストからの細胞の免疫単離するための機会を提供しています。このプラットフォームは、他の細胞型に適応することができます。

異なる系統にヒト胚性幹細胞（hESCの）の伝播との差別化のための3Dプラットフォームとしてのアルギン酸マイクロカプセル

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

16.2K ビュー.  The University of New South Wales. 我々は、内胚葉とドーパミン（DA）ニューロンへの伝播および胚性幹細胞の分化のための効果的な3Dプラットフォームとしてマイクロカプセル化技術を最適化しました。また、移植時にホストからの細胞の免疫単離するための機会を提供しています。このプラットフォームは、他の細胞型に適応することができます。

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Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

The field of human trophoblast research aids in understanding the complex environment established during placentation. Due to the nature of these studies, human in vivo experimentation is impossible. A combination of primary cultures, explant cultures and trophoblast cell lines1 support our understanding of invasion of the uterine wall2 and remodeling of uterine spiral arteries3,4 by extravillous trophoblast cells (EVTs), which is required for successful establishment of pregnancy. Despite the wealth of knowledge gleaned from such models, it is accepted that in vitro cell culture models using EVT-like cell lines display altered cellular properties when compared to their in vivo counterparts5,6. Cells cultured in the rotating cell culture system (RCCS) display morphological, phenotypic, and functional properties of EVT-like cell lines that more closely mimic differentiating in utero EVTs, with increased expression of genes mediating invasion (e.g. matrix metalloproteinases (MMPs)) and trophoblast differentiation7,8,9. The Saint Georges Hospital Placental cell Line-4 (SGHPL-4) (kindly donated by Dr. Guy Whitley and Dr. Judith Cartwright) is an EVT-like cell line that was used for testing in the RCCS.
The design of the RCCS culture vessel is based on the principle that organs and tissues function in a three-dimensional (3-D) environment. Due to the dynamic culture conditions in the vessel, including conditions of physiologically relevant shear, cells grown in three dimensions form aggregates based on natural cellular affinities and differentiate into organotypic tissue-like assemblies10,11,12 . The maintenance of a fluid orbit provides a low-shear, low-turbulence environment similar to conditions found in vivo. Sedimentation of the cultured cells is countered by adjusting the rotation speed of the RCCS to ensure a constant free-fall of cells. Gas exchange occurs through a permeable hydrophobic membrane located on the back of the bioreactor. Like their parental tissue in vivo, RCCS-grown cells are able to respond to chemical and molecular gradients in three dimensions (i.e. at their apical, basal, and lateral surfaces) because they are cultured on the surface of porous microcarrier beads. When grown as two-dimensional monolayers on impermeable surfaces like plastic, cells are deprived of this important communication at their basal surface. Consequently, the spatial constraints imposed by the environment profoundly affect how cells sense and decode signals from the surrounding microenvironment, thus implying an important role for the 3-D milieu13.
We have used the RCCS to engineer biologically meaningful 3-D models of various human epithelial tissues7,14,15,16. Indeed, many previous reports have demonstrated that cells cultured in the RCCS can assume physiologically relevant phenotypes that have not been possible with other models10,17-21. In summary, culture in the RCCS represents an easy, reproducible, high-throughput platform that provides large numbers of differentiated cells that are amenable to a variety of experimental manipulations. 
In the following protocol, using EVTs as an example, we clearly describe the steps required to three-dimensionally culture adherent cells in the RCCS.

Traditional, two dimensional cell culture techniques often result in altered characteristics with respect to differentiation markers, cytokines and growth factors. Three-dimensional cell culture in the rotating cell culture system (RCCS) reestablishes expression of many of these factors as shown here with an extravillous trophoblast cell line.

ヒト細胞培養のための回転細胞培養システム：モデルとしてのヒト栄養膜細胞

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

生物工学

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to high levels of NK cells after 4 weeks culture and can undergo further 2-log expansion with artificial antigen presenting cells. hESC- and iPSC-derived NK cells developed in this system have a mature phenotype and function. The production of large numbers of genetically modifiable NK cells is applicable for both basic mechanistic as well as anti-tumor studies. Expression of firefly luciferase in hESC-derived NK cells allows a non-invasive approach to follow NK cell engraftment, distribution, and function. We also describe a dual-imaging scheme that allows separate monitoring of two different cell populations to more distinctly characterize their interactions in vivo. This method of derivation, expansion, and dual in vivo imaging provides a reliable approach for producing NK cells and their evaluation which is necessary to improve current NK cell adoptive therapies.

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

This protocol describes the development, expansion, and in vivo imaging of NK cells derived from hESCs and iPSCs.

開発、展開、および<em生体内で&gt;</em&gt;ヒト胚性幹細胞（ヒトES細胞）からヒトNK細胞のモニタリングとや人工多能性幹細胞（性IPSC）

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

堅牢、マイクロ流体細胞内送達プラットフォームとしての細胞絞る

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

シングルセルおよび3D閉じ込めにおける単一胚を注文：ハイコンテントスクリーニングのための新しいデバイスを

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential mechanosensing characteristics. Engineering and analysis of these tissue types remain a challenge. Layered hydrogel constructs provide an opportunity for investigating the interactions among multiple cell populations within single constructs. Alginate hydrogels are both biocompatible and allow for easy isolation of cells after experimentation. Here, we describe a method for the development of small sized dual layered alginate hydrogel discs. This process maintains high cell viability of human mesenchymal stem cells during the formation process and these layered discs can withstand unconfined cyclic compression, commonly used for stimulation of hMSCs undergoing chondrogenesis. These layered constructs can potentially be scaled up to include additional levels, and also be used to segregate cell populations initially after layering. This dual layer alginate hydrogel culture platform can be used for many different applications including engineering and analysis of cells of load bearing tissues and co-cultures of other cell types.

Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct.

階層化アルギン酸構築：異種細胞集団の共培養のためのプラットフォーム

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

微細と3D微小血管の組立

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞における単細胞光学作用電位測定

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, unlike more differentiated progenitors, and enter the cell cycle rapidly after chemotherapy or irradiation to treat bone marrow injury or in vitro culture. By mimicking the bone marrow microenvironment in the presence of abundant fatty acids, cholesterol, low concentration of cytokines, and hypoxia, human HSCs maintain quiescence in vitro. Here, a detailed protocol for maintaining functional HSCs in the quiescent state in vitro is described. This method will enable studies of the behavior of human HSCs under physiological conditions.

This protocol enables the maintenance of quiescent human hematopoietic stem cells in vitro by mimicking the bone marrow microenvironment using abundant fatty acids, cholesterol, lower concentrations of cytokines, and hypoxia.

静止ヒト造血幹細胞を維持する培養法

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...

Real-Time Intravital Multiphoton Microscopy to Visualize Focused Ultrasound and Microbubble Treatments to Increase Blood-Brain Barrier Permeability

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles has emerged as an effective method to transiently and locally increase the permeability of the BBB, facilitating para- and transcellular transport of drugs across the BBB. Imaging the vasculature during ultrasound-microbubble treatment will provide valuable and novel insights on the mechanisms and dynamics of ultrasound-microbubble treatments in the brain.
Here, we present an experimental procedure for intravital multiphoton microscopy using a cranial window aligned with a ring transducer and a 20x objective lens. This set-up enables high spatial and temporal resolution imaging of the brain during ultrasound-microbubble treatments. Optical access to the brain is obtained via an open-skull cranial window. Briefly, a 3-4 mm diameter piece of the skull is removed, and the exposed area of the brain is sealed with a glass coverslip. A 0.82 MHz ring transducer, which is attached to a second glass coverslip, is mounted on top. Agarose (1% w/v) is used between the coverslip of the transducer and the coverslip covering the cranial window to prevent air bubbles, which impede ultrasound propagation. When sterile surgery procedures and anti-inflammatory measures are taken, ultrasound-microbubble treatments and imaging sessions can be performed repeatedly over several weeks. Fluorescent dextran conjugates are injected intravenously to visualize the vasculature and quantify ultrasound-microbubble induced effects (e.g., leakage kinetics, vascular changes). This paper describes the cranial window placement, ring transducer placement, imaging procedure, common troubleshooting steps, as well as advantages and limitations of the method.

This protocol describes the surgical and technical procedures that enable real-time in vivo multiphoton fluorescence imaging of the rodent brain during focused ultrasound and microbubble treatments to increase blood-brain barrier permeability.

リアルタイムの生体内多光子顕微鏡で、血液脳関門透過性を高める、集中超音波治療とマイクロバブル治療を可視化

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles ...

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. These include the limited number of cadaveric pancreas donors and the long-term use of immunosuppressants. Mesenchymal stem cells (MSCs) have been considered to be a potential candidate as an alternative source of islet-like cell generation. Our previous reports have successfully illustrated the establishment of induction protocols for differentiating human dental pulp stem cells (hDPSCs) to insulin-producing cells (IPCs). However, the induction efficiency varied greatly. In this paper, we demonstrate the comparison of hDPSCs pancreatic induction efficiency via integrative (microenvironmental and genetic manipulation) and non-integrative (microenvironmental manipulation) induction protocols for delivering hDPSC-derived IPCs (hDPSC-IPCs). The results suggest distinct induction efficiency for both the induction approaches in terms of 3-dimensional colony structure, yield, pancreatic mRNA markers, and functional property upon multi-dosage glucose challenge. These findings will support the future establishment of a clinically applicable IPCs and pancreatic lineage production platform.

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

This protocol presents a comparison between two different induction protocols for differentiating human dental pulp stem cells (hDPSCs) toward pancreatic lineages in vitro: the integrative protocol and the non-integrative protocol. The integrative protocol generates more insulin producing cells (IPCs).

インビトロ 膵臓系統に向けたヒト歯髄幹細胞の誘導

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. ...