このプロトコルは、固体核磁気共鳴、NMR、および複合生体システム特性解析のための実験である動的核分極(DNP)のための真菌および植物材料を調製するために使用することができる。この技術により、生体材料を、例えば全細胞の天然環境で原子分解能レベルまで調査することができます。真菌材料に関する高解像度の構造情報の取得は、抗真菌薬の開発に役立ちます。
この方法は、真菌細胞壁における複雑な炭水化物の組成および構造に関する洞察を提供し、植物、真菌、藻類、細菌を含む多くの炭水化物が豊富な生物に適用することができる。一部の研究者は、彼らの細胞培養における真菌汚染に苦しむかもしれません.私のアドバイスは、この汚染を防ぐために使用する前に、媒体と機器を徹底的に殺菌することです。
このデモンストレーションは、NMRや細胞培養の経験がほとんどない研究者が、真菌および植物システムでこれらの技術を実装する方法を学ぶのに役立ちます。無標識液体成長培地を調製するには、6.5グラムの酵母エキスペプトンデキストロースまたはYPD粉末を100ミリリットルの蒸留水に溶解し、得られた溶液を摂氏134度で25分間オートクレーブします。ラベルなしの固形成長培地を調製するには、蒸留水100ミリリットルに6.5グラムのYPD寒天粉末を加え、培地を摂氏121度で25分間オートクレーブしてから、培地を約50°Cに冷却します。
次に、溶かした固形成長培地の13〜15ミリリットルを個々の無菌プラスチックペトリ皿に移し、すぐに蓋を皿の上に置きます。炭素13、窒素15標識液体成長培地を調製するために、必要に応じて酸または塩基で6.6のpHに同位体含有最小培地の100ミリリットルの体積を調整します。次に、表に記載されている塩を蒸留水100ミリリットルに溶解し、炭素-13に添加し、窒素15標識された液体成長培地に加え、得られた溶液を摂氏121度で25分間オートクレーブします。
溶液が室温まで冷却されたら、炭素-13、窒素15標識最小培地の全容に100マイクロリットルの微量元素溶液を加えます。真菌材料を成長させるために、少量の真菌を貯蔵からYPDプレートに移すために接種ループを使用し、30°Cのインキュベーターで2日間真菌を培養する。インキュベーションの最後に、新しい接種ループを使用して、活性成長性真菌端を炭素-13、窒素15標識液体成長培地に移し、30°C、1分あたり220回転の培養液を揺れ動くインキュベーターに3〜5日間置きます。
大量の真菌がフラスコ底部を覆い液体に浮かべた場合は、遠心分離により真菌を回収し、上清を捨てます。適切な溶液でペレットを水和し、鉗子を使用してNMRおよびDNP分析のために十分に水和されたペレットの約0.5グラムを収集する。次に、残りの材料を円錐チューブに20%グリセロール溶液と混合し、長期保存のためにマイナス80°Cで真菌サンプルを置きます。
固体NMR分析のためにA.fumigatusを調製するために、最初に3.5キロダルトン分子量カットオフを備えた透析袋を使用して、0.5グラムの炭素-13、窒素15標識された真菌サンプルを摂氏4度の1リットルに対して透析し、3日間、成長培地から小分子を除去します。透析の終わりに、遠心分離のためにサンプルを15ミリリットルのチューブに移し、均一にカーボン13標識され、十分に水分を補給したサンプルペーストの70〜80ミリグラムを4ミリメートルのジルコニウム二酸化ローターに詰める。金属棒を使用して、余分な水を吸収するために紙を使用して、サンプルを穏やかに繰り返し絞ります。
次いで、ロータをしっかりとキャップし、固体NMR特性評価のために検光計にサンプルを挿入する。DNP分析のためにA.fumigatusを調製するには、炭素13、炭素15標識真菌サンプルあたり1.5ミリリットルマイクロ遠心分離管にDNPマトリックス100マイクロリットルを加え、各チューブに0.7ミリグラムの偏光剤を溶解して10ミリモルラジカルストックを形成します。ラジカルが溶液に完全に溶解していることを確認するために2〜3分間ボルテックスした後、偏光剤溶液の50マイクロリットルに透析炭素-13、窒素15標識真菌サンプルの10ミリグラムを浸し、害虫とモルタルを使用して混合物を穏やかに粉砕して多孔質細胞壁にラジカルの浸透を確実にする。
さらに30マイクロリットルのラジカル溶液を地盤ペレットに加え、真菌サンプルをさらに水和し、ペレットを3.2ミリメートルのサファイアローターに詰めます。実例のように、軽く絞って余分なDNP溶媒を取り除き、3.2ミリメートルのシリコーンプラグを加えて水和の損失を防ぎます。次に、マイクロ波照射下でDNP強化スペクトルを測定するために、ルーチン実験用のNMR分光計またはDNP分光計にロータを加える。
DNP研究用の植物材料を調製するには、カミソリの刃を使用して、均一に炭素13標識植物材料を1〜2ミリメートルに切断します。モルタルと害虫を使用して、最終的な粉末が均質な外観になるまで、より小さな粒子に粉砕します。植物材料に40マイクロリットルの10ミリモルラジカルストック溶液を加え、さらに5分間軽く粉砕してラジカルと均質な混合を確実にします。
別の20マイクロリットルのラジカルストック溶液でグランドサンプルを水和し、平衡化された植物サンプルを3.2ミリメートルのサファイアローターにパックしてDNP分析を行います。次に、シリコーンプラグを挿入して水和の損失を避け、試料をDNP分光光度計に積み込みます。同位体標識はNMR感度を大幅に高め、一連の2次元炭素-13-炭素-13および炭素-13-窒素-15相関スペクトルを測定し、ポリマーの組成、水和、移動性、および充填を解析し、細胞壁アーキテクチャの立体モデルの構築のための統合を可能にします。
2Dカーボン-13-カーボン-13スペクトルで対角線外の信号を得ることが困難な場合、統計的標識が生じた可能性があります。100万分の96と92の2つの炭素-13ピークは、グルコースのシグネチャーカーボン1信号です。したがって、35秒の長いリサイクル遅延で測定された定量的な炭素13直接偏光スペクトルにおけるそれらの強い強度は、典型的には不完全な透析または洗浄による小分子の優位性を示す。
適切に標識されたサンプルを使用すると、長い範囲の相関をさらに測定して生体分子の空間的近接を検出し、無傷の細胞壁の構造モデルを構築することができます。この技術により、多くの自然発生および工学材料の構造機能を探求することができ、炭水化物が豊富な生体材料および機能性ポリマーの将来の研究を促進する。真菌によっては、ヒトに感染や系統的な病気を引き起こす可能性があるため、保護のためにラミナルフローフードで真菌物質を扱い、暴露を最小限に抑えるようにしてください。
