この手順の目的は、純粋なシフトNMRによって植物抽出物を分析することです。以下のプロトコルには、さまざまな植物マトリックス、バニラの葉、ジャガイモ塊茎、ケープグーズベリー果実からのサンプル調製における重要な側面と、最適なピュアシフトサイケとSAPPHIREプシュケスペクトルを記録するための詳細なステップバイステップのNMR手順が含まれています。プロトンNMRによる代謝プロファイリングは、複雑な生物学的混合物のNMRスペクトル内の無数のシグナルをシグナルごとに分析する技術であり、この混合物中の各代謝物を同定することを目的としています。
その目的は、化学分類学、表現型、官能特性、原産地呼称、代謝反応など、植物科学の重要な分野に関連するバイオマーカーを描写することです。プロトンNMRは、代謝プロファイリングに一般的に使用されます。しかし、狭い製品スペクトル範囲に拡張多重度を持つ多数の信号は、広範囲にわたるオーバーラップにつながり、スペクトルの解析と解釈を複雑にします。
通常、1 つの共振の幅は 1 から 5 ヘルツの範囲です。ただし、高度に結合された信号は25ヘルツから50ヘルツ以上に広がる可能性があるため、信号がオーバーラップする可能性が高くなります。この制限を克服するために、最新のピュアシフトNMR法を適用して、3つの異なるプラントシナリオで示したようにスペクトル分解能を発表します。
サンプル調製、植物抽出物調製は多くの方法で行うことができ、手順はマトリックスによって異なります。ケープグーズベリーの果実は、最初にジュースに均質化されました。バニラの葉はそのまま使用し、ジャガイモは酸化から保護してスライスしました。
いずれの場合も、材料を凍結乾燥し、粉砕した後、抽出しました。ケープグーズベリーの果実とジャガイモのために、超音波処理によって助けられた抽出のために水を使用した。上清を遠心分離により回収し、任意の液体を凍結乾燥またはスピード真空により乾燥させた。
乾燥抽出物をシュウ酸緩衝液に再懸濁し、蒸発させて乾燥させ、TMSPを含むD2Oに再溶解しました。バニラの場合、TMSPを含む重水素化リン酸緩衝液と重水素化メタノールを使用して直接抽出しました。上清も遠心分離によって回収されました。
すべてのサンプルをPTFEシリンジフィルターでろ過し、NMRチューブに0.6ミリリットルのろ過溶液を充填しました。NMRメタボロミクスでのサンプル調製が重要です。この手順はおそらく何百回も繰り返されるため、観察された分散がサンプル調製によるものではなく、研究対象の植物間の実際の違いによるものであることを保証するために、まったく同じ方法で準備する必要があります。
ピュアシフトNMR。NMRスペクトルは、FID信号のフーリエ変換後に取得されます。FID信号は、化学シフト変調とJ結合分割パターンに関与するJ結合変調の2つのコンポーネントに分解できます。
J結合変調は、J結合再集束要素によって再集束することができ、これにより、アクティブスピンは影響を受けないままパッシブスピンを選択的に反転します。2つの等しい遅延の後、化学Jカップリングは完全に再焦点化されます。反z-COSY実験に基づくPsycheエレメントは、最も堅牢で感度の高い広帯域リフォーカスエレメントの1つであり、NMRメタボロミクスに適した特性を備えています。
ピュアシフト実験は、化学シフト記録中にJカップリングの進化に再び焦点を合わせることに基づいています。これは通常、J結合の再集束ポイントを移動するために遅延を増やすことによって達成されます。化学シフトがJ結合よりも高い周波数で発生するため、同核分離結合実験をインタフェログラム方式で記録できます。
インタフェログラム取得は、J結合進化の再焦点化点と小さなチャンクによるFIDの記録で構成され、常に取得されたチャンクの中心と一致します。分離された FID は、連続する各チャンクを連結することによって構築されます。NMRデータ取得のセットアップ、サンプルをNMR分光計に移します。
プローブヘッドを調整して一致させ、サンプルをロックしてシムします。90度のハードパルスを校正します。標準的な1DプロトンNMRスペクトルを実行します。
精神実験。Bruker TopSpinライブラリからリセットサイケ1Dパルスシーケンスを選択します。スペクトル幅を 5 キロヘルツに設定します。
緩和回復遅延を少なくとも1秒または2秒に短縮します。ダミーは 16 までスキャンします。スキャンの数を64または128に、ブロックあたりの複素データポイントの数(64または128)によって、目的のチャープパルスフリップ角度励起が設定されます。
感度と低再結合アーチファクトの間の適切な条件は、チャープパルス帯域幅を定数61〜20度、10キロヘルツに設定することです。ハードパルス長を以前にキャリブレーションしたボリュームに設定し、サイケ形状パルス長を30ミリ秒に設定します。Crp_psycheを選択します。
サイケエレメントの20形状パルス。サイケエレメント中に適用されるパルスフィールド勾配の強度は、通常、プローブに応じて勾配の最大強度の1〜4%に設定されます。[RECT] を選択します。
1 はグラデーション形状パルスです。純粋なシフトFIDを再構築するために取得するブロックの数を設定します。通常、ブロックあたり64または128の複素点を持つ16または32のブロックは、十分なデジタル分解能を提供し、スペクトルを実行し、データを処理します。
ブルカーのproc_reset AUプログラム、そしてフーリエ変換を使用します。ゼロ充填とサインベルアポダイゼーションを使用してスペクトルを変換することをお勧めします。Psycheは、擬似的な2Dインターフェログラム実験です。
これは、各ブロックの取得中に小さなJカップリングの進化から到着する周期的なサイドスパンアーティファクトからのソフトウェアであり、通常、純粋な化合物の分析では5〜20ミリ秒の範囲であり、これらのアーティファクトは通常、親ピークの5%未満を表すため、無視できます。しかし、複雑な混合物では、一部の代謝産物のサイドスパンアーチファクトが、低濃度の代謝物のシグナルと同じかそれ以上に大きくなる可能性があり、代謝分析の精度が損なわれます。これらのアーティファクトは、Morris Lab SAPPHIRE精神実験で開発されたSAPPHIRE精神と呼ばれる精神実験の修正を使用して効率的に除去できます。
デカップリングされたスペクトルを達成するために、パルスシーケンスは、各ブロックの中央にあるJ結合でFID再フォーカスの小さなチャンクを取得します。ただし、各ブロックで小さなJ結合の進化が発生し、周期的な側波帯アーチファクトが生成されます。SAPPHIREサイケ実験は、J再集束点のシフトによって達成される系統的な位相変調によってこれらの周期的なアーティファクトが除去される通常のサイケシーケンスの修正です。
各位相変調を追加した後、残留J結合の進展は高度に抑制され、はるかにクリーンな純粋なシフトスペクトルが得られます。SAPPHIREサイケパルスシーケンスを選択し、パルスシーケンスパラメータを設定します。この配列はブルカーのレパートリーにはありませんが、配列と処理プログラムはマンチェスターNMR方法論グループのウェブサイトから入手できます。
標準パラメータは、5キロヘルツのスペクトル幅、少なくとも1秒または2秒の緩和遅延の値に設定されます。16 個のダミー スキャン、増分ごとに 8 回または 16 回のスキャン、D2 を 14 ミリ秒に設定。このパラメーターにより、緩和T2がJ変調インクリメントごとに一定に保たれるようになります。
目的のチャープ パルス反転角度励起値とパルス帯域幅を設定します。ハードパルス長を以前にキャリブレーションした値に設定し、サイケシェイプパルス長を30ミリ秒に設定します。サイケエレメントのPSYCHE_Saltire_10kHz_30m形状パルスを選択します。
サイケエレメント中に適用されるパルスフィールド勾配の強度を設定します。グラデーションの形状として RECT. 1 を選択します。
Sapphire Jの変調増分の数をF2(通常は8増分)に設定すると、サイドバンドアーチファクトの優れた抑制が保証されます。次の式を使用して、選択した F3 スペクトル ウィンドウ値から計算された F1 スペクトル ウィンドウと F2 スペクトル ウィンドウを設定します。SW1 上の 1 として記述される純粋なシフト ブロック期間は、通常 20 から 40 ミリ秒の間で設定されます。
純粋なシフトブロックの数を設定します。SAPPHIRE psycheは最初のブロックのデカップリング位相変調を補償する必要があるため、追加のブロックを追加する必要があります。通常、17ブロックまたは33ブロックで十分なデジタル解像度が得られます。
データを処理し、pm_pshiftおよびpm_fidadd AUプログラムで実行し、フーリエ変換に続いて、ゼロフィリングを使用してスペクトルを変換し、ベルアポダイゼーションを割り当てることをお勧めします。その結果、SAPPHIREの精神実験では、3つの異なる植物マトリックスで示されているように、結合共鳴をうまく鋭いシングレットに折りたたむことにより、スペクトル分解能が向上しました。バニラの葉、Physalis Peruvianaの果実、SAPPHIRE Psyche複合体の多重度を持つジャガイモ塊茎など、40ヘルツを介してほぼ連続的な信号を生成するホモクエン酸の高度に結合した水素は、3つの鋭い一重項に崩壊しました。
エリア内の他の信号を覆い隠している可能性のある混雑を減らします。また、分解能の向上により、ホモクエン酸がラクトンであり、リンゴ酸の共鳴が現れる2.6〜2.8 PPMの高度に重なり合った領域を明確に解きほぐすことができました。例えば、通常のプロトンNMRでグルコシドのシグナルと重複するバニラの主要なバイオマーカーは、この優れた分解能の向上により、SAPPHIREスペクトルでより明確に特定されました。結論。
ピュアシフトは、植物メタボロミクスのための優れた新しいツールです。これにより、スペクトル分解能が大幅に向上したため、代謝物の同定が容易になり、相関指標の解析が細かくなり、多変量解析の解釈が容易になりました。このビデオを見れば、NMR分析のためのさまざまなプラン抽出物の調製方法や、最適なピュアシフトサイケとSAPPHIREサイケスペクトルの記録方法についてよく理解することができます。
