ここでは、このような繊細なフィルムの取り扱いを容易にする新しい浮揚ブロックを使用して、サポートフィルムでクライオEMサンプルを調製するための改良されたプロトコルを紹介します。この方法の主な利点は、変性のような有害な影響が発生する空気水界面からサンプルが保護されていることです。ここで示すプロトコルの1つは、グラフ化親水性をレンダリングするための高価な処理を避けるため、EMコミュニティ全体へのアクセス性を高めます。
小さな浮遊装置は、良好な準備のために電気顕微鏡でまだ広く使用されていません。したがって、これらの視覚的なデモンストレーションは、その使用のためのベンチマークを提供することができます。まず、TEMグリッドを二重蒸留水と酢酸エセルで洗浄し、続いてプラズマ洗浄を行います。
次に、サンプルの10〜12マイクロリットルを緩衝液交換ウェルに加え、浮遊ブロックと2%小便尿酢酸溶液の10〜12マイクロリットルを隣接する非緩衝液交換ウェルに加えて、負の染色のために十分に交換する。汚れで作業する際には、適切な安全対策を講じる必要があります。慎重に上に事前堆積カーボンフィルムとマイカの2つの小片をカット。
マイカの破片は、炭素が浮遊している間に断片が井戸の上に座ることができ、ピンセットで断片を処理するのに十分なスペースがあるように、井戸の長さよりも井戸に収まるほど広いことを確認してください。マイカがウェルのランプに座り、液体サンプルの表面でカーボン層が観察されるまで、ほぼ45度の角度でマイカを井戸に浸します。サンプルでカーボンをインキュベートした後、マイカシートを非常にゆっくりと引き出して、カーボンフィルムを回収し、残存粘度試料保持を最小限に抑えます。
下段の非炭素表面を濾紙でタップしてマイカを慎重にブロットし、過剰な液体を除去し、マイカフラグメントを2%小便尿酢酸溶液を含む反対側ウェルに浸し、炭素層を負の汚れと交換する。洗浄され、プラズマ洗浄EMグリッドの聖なる炭素被覆側で浮遊炭素層を回収します。その後、TEM上でイメージングするまでグリッドを空気乾燥したままにし、好ましくは空中汚染を避けるためにそれらを覆います。
先に示したようにTEMグリッドを洗浄した後、使用直前に酸化グラフェン懸濁液を調製し、渦を徹底的に行ってください。その後、4つの非緩衝液交換井戸に10〜12マイクロリットルの酸化グラフェン懸濁液を加える。浮揚ブロックに沿って。
ブロックの残りの4つの緩衝液交換井戸に10〜12マイクロリットルの二重蒸留水または超純水を加えます。各ウェルのグラフェン酸化物懸濁液に4つのグリッドを穏やかに落とし、1分間インキュベートして、聖なる炭素被覆側が溶液に接触していることを確認します。1分後、ピンセットを各非バッファ交換のピンセット溝に滑り込まして、各グリッドを慎重に回収します。
水滴がグリッドに見えるまで、隣接する井戸の二重蒸留水で各グリッドの銅非炭素被覆側を穏やかに簡単に微調整します。その後、慎重にフィルター用紙の一部に対してグリッド水のドロップを逆さまに保持します。グリッドを覆い、ピンセットに入れて空気を乾かします。
ガラススライドに堆積した銅グラフシートの上に4つの洗浄グリッドを配置し、各グリッドをイソプロパノールの滴で覆い、単層グラフェンとグリッドの間に親密な接触を可能にします。イソプロパノールの完全な蒸発後、ガラスペトリ皿の塩化第二鉄溶液にグリッドを持つ銅グラフェンシートを浮かべます。その後、空気中の汚染を避けるために皿を覆い、一晩室温でエッチングにしておきます。
TEMグリッドサイズよりも大きな直径のループを使用して、グラフェン単層に浮かぶグリッドを釣り上げ、洗浄用の二重蒸留水を含むガラスペトリ皿に慎重に移します。グリッドを水で2回洗い、サンプル調製と凍結が完了するまでサンプルバッファーを含むペトリ皿にグリッドを移します。浮遊ブロックのウェルにサンプルの10〜12マイクロリットルを加えます。
サンプルがブロックで準備ができたら、きれいなピンセットのペアを使用してバッファ溶液からグラフェンコーティングされたグリッドを選び、それをよく含むサンプルの表面に置きます。適切なインキュベーション期間の後、きれいな凍結ピンセットでグリッドを拾い、ブロッティングとガラス化を進めます。支持浮揚ブロックで調製された負の染色されたグリッドは、典型的には、グリッド表面全体にわたってアモルファスカーボンで覆われる。
炭素膜の破損は、いくつかの例では発生するが、グリッドの正方形の多数は、手付かずであるため、負の染色目的に適用されます。同様に、良好なフィルムカバレッジは、グラフェン酸化物プロトコルを使用してグリッド全体にわたって日常的に達成されます。酸化グラフェングリッドは原料から迅速に調製することができ、サンプルの保護が高い。
グラフェンを凍結直前に濡れ、サンプル塗布をその場で維持することは、クライオEMに適した氷層を生成するのに十分です。このプロトコルは、グラフェン親水性をレンダリングする機器を必要とせず、サンプル回収の利点を提供します。支持浮揚ブロックは、グリセロール勾配から派生したサンプルのために非常に有用であるC2でバッファ拡張を可能にする各ウェルの部位に2つの針ポートを有する。
浮遊ブロックは、小容量の制御可能な緩衝液流と機能化された支持膜を利用して、グリッドアフィニティー精製法の探索を可能にした。
