この生理学的に関連する自反応性発芽中心のキメラモデルは、細胞の局在を下流の分子分析とインビボで結び付け可能にする。自己反応性胚中心の混合キメラモデルの主な利点は、その汎用性と限界の性質であり、事実上任意の所望の細胞サブセットまたは分子経路の尋問を可能にする。自己免疫疾患開発のこのモデルの生理学的関連性は、新しい治療法の進歩を助けるかもしれない新しい洞察を可能にする。
この骨髄キメラモデルは、免疫学、免疫腫瘍学、幹細胞研究に使用できます。光活性化成分は、組織局在化を下流細胞分析にリンクするため、幅広い使用法を有する。骨髄の準備と再構成および生体内の標識および組織の排泄ステップはすべて、視覚的なデモンストレーションに適した技術的に複雑な手順である。
ドナー564Igiマウス大腿骨および脛骨を抽出するには、後肢1本から皮膚を取り除き、足を引っ張って膝関節と足首関節を飛び出す。足首関節を壊すために進みます。その後、脛脛につかまりながら足を体に向かって引っ張り、それによって脛脛筋から腱と筋肉を剥ぎ取る。
膝関節を折って脛骨を解放し、大腿骨につかまりながら骨を体に向かって引っ張り、大腿骨から腱と筋肉を取り除きます。次に股関節を切開し、股関節から大腿骨を引き出す前に腱を切ります。同様の方法で対側の後肢の骨を取り除いた後、残りの筋肉と結合組織を取り除くために粗いペーパータオルで骨を慎重にこすり、氷冷骨髄緩衝液で剥がされた骨をすすいだ。
その後、デュモン番号7鉗子を使用して、骨を氷上の新鮮な骨髄緩衝液の容器に移す。骨髄細胞を抽出するには、氷冷骨髄バッファーでモルタルを洗い流し、10ミリリットルの血清ピペットを使用して、洗浄バッファーを新鮮な氷冷骨髄バッファーの 10 ミリリットルに置き換えます。鉗子を使用して骨をモルタルに移し、害虫を使って骨をつぶして粉砕して骨髄を放出します。
10ミリリットルのピペットを使用して骨髄抽出物を採取してから、骨髄溶液を70マイクロメートルの細胞ストレーナーを通して氷上の50ミリリットルの円錐管に入ります。次に、新鮮な氷冷骨髄バッファーの追加 10 ミリリットルでモルタルをリンスし、細胞の完全な回復を確保します。ドナー懸濁液を調製するには、50ミリリットル円錐状チューブに光活性化可能なGFPおよび564Igiドナー骨髄の適切な量を混合し、遠心分離によって細胞をペレットにする。
混合細胞ペレットを氷冷骨髄緩衝液1ミリリットル当たり10倍の濃度で再懸濁し、細胞を氷上の予め冷却された1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移す。次に、麻酔付きCD45.1レシピエントマウスのつまみへの応答の欠如を確認し、ドナー骨髄細胞のチューブをフリックして十分な再懸濁を確実にする。200マイクロリットルの骨髄混合物を1つの0.3ミリリットル、30ゲージのインスリン注射器にロードし、レシピエントを横にして、目の上下の皮膚を穏やかに伸ばして目をわずかに飛び出します。
目と周囲の組織を避けるように注意して、目のソケットの前部に約30度の角度で注射器の先端を慎重に挿入します。針の先端が眼窩の下にある骨に触れたとき、針を約0.5ミリメートル引き込んでから、安定した圧力を使用してドナー骨髄をゆっくりと注入する。その後、完全に回復するまで監視して、アドリビタム抗生物質水でマウスをケージに戻します。
ポピトリリンパ節に標識するには、PBSの18マイクロリットルでフィコエリトリン標識ラット抗マウスCD169抗体の2マイクロリットルを希釈し、抗体の2つの10マイクロリットルの液滴をプラスチックパラフィンフィルムに加える。各液滴を30ゲージ針で1本の0.3ミリリットルのインスリン注射器にロードし、麻酔付きレシピエント動物のフットパッドに10マイクロリットルの抗体を注入する。リンパ節を収穫する前に、平らな表面に正方形のカバースリップを置き、真空グリースを積んだ5ミリリットルのシリンジを使用して、各エッジから約1〜2ミリメートルのグリースでカバースリップの端を追跡します。
チャンバーを冷たい平らな表面に移し、真空グリースチャンバに氷冷骨髄バッファーを充填します。白モリリンパ節にアクセスするには、まっすぐで細かいはさみを使用して安楽死させたレシピエント動物の膝の下の皮膚を切開し、ハムストリングラインに沿って切り傷を股関節までほぼ伸ばします。デュモン番号5またはナンバー7鉗子を使用して、皮膚の露出したフラップのそれぞれを外側に引っ張ってポ窩の組織を露出させ、鉗子を使用して窩のちょうど内側の窩を慎重にポッテリン静脈に入れる。
脚の軸に沿って鉗子を開閉して、親指と人差し指を使用して前側から膝に四頭筋をつまむ前に、下の方の頭突起リンパ節を露出させ、リンパ節をフォッサから飛び出す。リンパ節の下に鉗子をスライドさせて、周囲の組織からノードを解放し、真空グリースチャンバーに置きます。2番目のリンパ節が採取されたら、2つ目のカバースリップを真空グリースリムに置き、静かに押し下げてチャンバーを閉じ、すべての気泡を押し出します。
採取した脾臓組織サンプル中の胚中心を特定するには、イメージングチャンバーを2光子蛍光顕微鏡のステージに置き、3.5ミリリットルのプラスチック転写ピペットを使用して、上部カバースリップの上に蒸留水を一滴置きます。接触点まで目的を下げ、透過光を使用して組織の上部に焦点を当てます。ダークモードと2光子励起に切り替え、レーザーを940ナノメートルに調整します。
組織の表面近くに染色したCD169によって接する個々の白果円部分を見つけ、中央動脈に関連する第2の高調波発生によってペリアルテラーリンパ部鞘を同定する。周動脈膜リンパ腫鞘と限界領域の間のゾーンでは、高自己蛍光性、活性化された帯状体マクロファージの存在を特定し、これらのランドマークを使用して、単一の胚中心領域の周りに関心のある領域を描きます。その後、深さ100~150マイクロメートルのZスタックを設置し、組織の表面から始まり、約3マイクロメートルのステップサイズを使用してから830ナノメートルの励起波長に切り替えます。
検出器の光の損傷を防ぐために、すべてのチャネルを遮断または暗くし、スタックをイメージします。次に、940ナノメートルの励起波長に戻り、チャネルを再び開き、スタックをスキャンして効率的な光活性化と画像スタック全体の光損傷がないことを確認します。混合骨髄キメラの血清型は、564Igiコンパートメントに由来する9D11陽性循環B細胞の低周波で、再構成後6週間で正規化されたB細胞数を明らかにする。
全リンパ球ゲート内には、残存レシピエント由来細胞の低周波があり、その約6%がCD45.1由来であり、B細胞区画におけるキメラリズムの全体的な程度が約94%あり、光活性化可能なGFP骨髄由来B細胞の優位性があり、564Igi-Bの重い負選択の結果であった。観察されるように、CD169によるin vivo標識は、限界領域の強い視覚化を容易にする。第2の高調波シグナルは、コラーゲン含有構造元素および主要血管において、動脈周囲リンパ腫鞘の中央動脈および高自己蛍光性の高い、生殖中心活性に関連する活性化された帯状体マクロファージを含む明らかである。
これらのデータを組み合わせることで、単一の光活性化可能な発芽中心を含む可能性が高い関心領域の同定が可能になる。下流のフローサイトメトリック評価は、正規化されたB細胞区画数、自発的な発芽中心集団、および光活性化された発芽中心B細胞のサブセットの存在をさらに確認する。十分な細胞生存率を確保するためには、出植、光活性化、および組織処理のステップの総ターンアラウンド時間を4〜6時間に制限することが重要です。
この光活性化細胞は、フローソートされ、単一細胞シーケンシングを行い、例えば、単一の胚中心のB細胞受容体レパートリーを特徴付けることができる。混合キメラモデルは、例えば、エピトープ拡散のプロセスがどのように展開するかについての洞察を提供するなど、新しい深さで自己反応性発芽中心生物学の探査を可能にしました。2光子顕微鏡の光源は、目に深刻な損傷を与える可能性のある非常に強力なパルスクラス4レーザーであることに注意してください。
