Name: spatial and temporal control of t cell activation using a photoactivatable agonist
Uploaded: 2018-04-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
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アドバイスと支援の布施研究室のメンバーに感謝いたします。米国国立衛生研究所 (R01-AI087644 かに)、メモリアル ・ スローン ・ ケタリング癌センターに P30 CA008748 によってサポートされています。

1. 刺激ガラス表面の準備
<ol><li>ビオチン化ポリ L-リジン (バイオ PLL) のコート 8 ウェル腔症 coverglass 希釈蒸留水、脱イオン水 (ddH2O) のレバレッジです。部屋の温度 (RT) で 30 分間インキュベートします。</li>
	<li>H2O を洗う</li>
	<li>室温 2 時間ドライ</li>
	<li>塗装室温 30 分間ブロック バッファー (HEPES 緩衝生理食塩水 【 10 mM HEPES ペーハー 7.4、150 mM の NaCl、2 %bsa を用いた) と面のブロック バイオ PLL<ol>
<li>10 mM ナポ4、pH 8.5 の 1 mL 中ポリ L リジン臭化水素酸塩 5 mg を溶解します。</li>
		<li>(DMSO 入荷 100 mg/mL) から NHS ビオチンの 125 μmol (0.55 mg) を追加し、反応の pH をチェックします。PH が 8.5 以下の場合は、pH 8.5 と 9.5 の間にそれを高めるために 4 N NaOH の 2 μ L を追加します。</li>
		<li>30 分の渦。</li>
		<li>20 mM Tris pH 8.0 に溶解し 100 mM グリシンの 50 μ L で反応を消します。</li>
		<li>10 分間フルパワーで回転し、上清を新しいチューブに転送します。 注: バイオ PLL 品質は 96 ウェル elisa 用プレートの上に材料のシリアルの 2 倍希釈液を塗布し、アルカリ性ホスファターゼの孵化はストレプトアビジン結合後にビオチン含量を定量化の前準備と比較して通常。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ブロック バッファーを削除します。井戸を乾燥させるようにしてください。ストレプトアビジン (ブロック バッファー 100 μ g/mL) を追加します。4 ° C で 1 時間インキュベートします。</li>
	<li>HBS で洗ってください。記入し、井戸から HBS の取り外し 4-5 回、チャンバー スライド井戸を反転します。井戸を乾燥させるようにしてください。</li>
	<li>ビオチン標識 pMHC 配位子と接着分子を表面に追加します。 注: MCC と OVA オルソ ニトロベンジルを追加することによって photocaged による可能キー リシンの ε-アミノ基を保護基 (例えばnitrophenylethyl (NPE) または nitroveratryloxycarbonyl (NVOC)) (MCC、OVA で K7 で K12)。Photocaged MCC と OVA は、商用ベンダーから入手できます。緩衝水溶液で溶解後彼らは大腸菌で発現させた-Ekと確立されたアプローチ11,12で H2 Kbに refolded です。</li>
	<li>活性型クライアントまたは OVA ペプチドの検証<ol>
<li>ハンドヘルド UV ランプで紫外線照射することにより NVOC で保護されたペプチドを decage (材料表参照) 室温に 20 分間</li>
		<li>パルス 1.0 x 105 Apc nonstimulatory ペプチド (否定的な制御、例えばHb)、1 μ m は、1 h の活性型ペプチド、照射活性型ペプチドおよびアゴニスト ペプチド (肯定的な制御、例えばMCC) を非照射37 ° C で一晩します。</li>
		<li>5 C を発現する T 細胞を刺激するためにC7/2B4/と TCR や使用 CH12 CH27 B 細胞OT1 T 細胞を刺激するには、RMA-s または EL4 胸腺細胞を使用します。</li>
		<li>T 細胞の数と同じ数のパルスの Apc をミックス 96 ウェル底板 200 の最終巻でラウンド μ L。 37 ° C、12-24 時間で孵化させなさい。</li>
		<li>各ウェルから培養上清を回復し、ストレプトアビジン西洋わさびの過酸化酵素比色検出で elisa 法による IL-2 を分析します。 注: ケージすべてのペプチッド MHC 複合体に巻き戻しする前にエレクトロ スプレー質量分析法による現況の確認は強くお勧めします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>折りたたみと光への露出を最小限に抑えるために MHC の浄化を実行します。たとえば、アルミ箔の折れたたみ反応をラップし、UV ランプ消灯をゲルろ過クロマトグラフィーを行います。 注: それはその活性型 MCC Ekを発見されているし、OVA-H2 Kbが不完全な機能ケージングのための高密度 UV 独立した T 細胞の活性化を誘導します。したがって、活性型 pMHC は、固定ステップの間に nonstimulatory pMHC (例えば- Ekヘモグロビン64 76ペプチド (Hb) を含む) の 10-30 x 過剰に希釈されています。これは、信号対ノイズ比以降イメージング実験の向上します。</li>
	<li>Photoactivate CD4 に+ T 細胞、総称クラスに対してビオチン化抗体、ビオチン化活性型 MCC Ek (0.1 μ g/mL)、ビオチン化 Hb Ek (3 μ g/mL) の混合物を使用して私は MHC H2 Kk (0.5 μ g/mL). アンチ H2 Kk抗体は 5 C を奨励C7/2B4/と T 細胞は、H2 Kk、活性化を経ることがなくガラス表面上に広がる表現。</li>
	<li>CD8 の+ T 細胞は、ビオチン化ペプチド KAVYDFATL のベアリング H2 Dbの混合物を使用 (1 μ g/mL)、ビオチン化活性型 OVA H2 Kb (0.1 μ G/ml)、ICAM 1 接着分子の細胞外ドメイン (2 μ g/mL昆虫の細胞培養13によって生成)。ICAM 1 は、T 細胞表面のインテグリン LFA1 の従事によって近いコンタクト形成を奨励しています。</li>
	<li>RT で 1 時間または 4 ° C で少なくとも 2 時間の潜伏が続くブロックのバッファーのすべての蛋白質の混合物を適用します。 注: ~ 8000 μ m2ごとにこの種の表面の分子の密度は、以前に決定された6をされています。活性型 pMHC ~1/30 を表すことを考えるその密度の表面のビオチン化タンパク質のthは μ m2、decaging 前あたり 267 ~ 分子になります。</li>
	<li>ステップ 1.6 のように洗浄し、使用する準備ができるまで HBS に残します。</li>
	<li>200,000 CD4 を追加+または CD8+ T 細胞の各ウェルに適切な TCR を表現でき、37 ° C 15 分で付着する細胞。細胞に接続されているし、表面の上に広げ、光と画像の準備ができています。 注: エフェクター T 細胞蛍光イメージング プローブのレトロ ウイルスの伝達は、詳細 elswhere6,7で説明されます。カルシウム シグナルも研究できるカルシウム敏感な染料蛍光 46搭載 untransduced の T 細胞を用いたします。レシオ メトリック色素も活性型 pMHC の decaging を誘発する紫外線の範囲における励起が必要なために、フラ 2 は推奨されません。</li>
</ol>2. 画像の取得
<ol><li>画像取り込み用 UV 対応 150 X 対物レンズと倒立の全反射顕微鏡を使用します。UV 照射 100 W 水銀ランプ (HBO) に接続されたデジタル ダイヤフラム システムを使用してユーザー定義の領域です。400 nm ロングパス ミラーを使用してサンプルにこのランプから紫外線を直接します。</li>
	<li>ローカライズされた光と時間経過の取得イメージ解析ソフトウェアを使用します。ほとんどの実験では 488 を使用して緑と赤の両方のチャネルにプローブを監視 nm と 561 nm 励起レーザー、それぞれ。レーザー光は、(decaging を有効にする) に紫外線範囲の送信もデュアル帯域ダイクロイック ミラーを使用してサンプルに指示されます。顕微鏡の構成については、材料表と図 6をご覧下さい。</li>
	<li>T 細胞を含むチェンバー スライドをマウントした後、必要に応じて、全反射や落射蛍光照明を取得する設定を調整します。ライブ ・ モードでの関心の蛍光の渦を表現しているセルのフィールドを選択します。ソフトウェア コントロールを使用して個々 のセルの下にある光のミクロン スケール領域を確立します。</li>
	<li>コマ撮りの集録を開始します。5 の間隔で 80 の縦長の取得、通常、時間の各ポイントの間の s。これはシーケンシャル 488 よりも十分な時間を残します nm とデュアル カラー実験の場合、563 の nm 露光。</li>
	<li>後 10 縦長、photoactivate デジタルのダイヤフラムを開くことによって選択された領域 1 1.5 秒のシャッターします。</li>
	<li>時間の経過が完了したら、セルの新しいフィールドを選択し、プロセスを繰り返します。</li>
</ol>3. データ分析
注: 固定化リガンドのローカライズされた光は、応答と細胞骨格の改造イベントをシグナル伝達の定量的解析に使用することができます明確に定義された、静止刺激領域を作成します。プロトコルは通常照射領域内の蛍光強度の定量化または距離測定位置のエンドポイントとして照射領域の使用を含む分析 (e.gに中心体の偏波を評価するため、。照射領域)。両方の分析のプロトコルは次のとおりです。様々 なインタラクティブな画像解析プログラムは、強度と追加の処理や分析の出力をすることができますし、距離の測定に使用できます。
<ol><li>
蛍光強度
	<ol>
<li>(FIb) 細胞外背景領域の蛍光強度 (FI) を決定します。これは、バック グラウンド補正のため使用されます。<ol>
<li>セルの外側ミクロン サイズの正方形の領域を描画し、マスクを作る。分析をクリックして蛍光強度を決定する |統計情報をマスク。平均蛍光強度を選択し、値をエクスポートします。 注: (例えば3.1.1.1) 手続きの詳細は、Slidebook ソフトウェアを参照してください (表の資料を参照してください)。他のソフトウェア パッケージを使用してこのプロトコルの実装 (例えば.、フィジー) わずかに異なるになります。</li>
		</ol>
</li>
		<li>各時点のセンサー領域内で FI を決定します。<ol>
<li>マスクされたセンサー領域を強調表示するを選択します。分析をクリックして蛍光強度を決定する |統計情報をマスク。平均蛍光強度を選択し、値をエクスポートします。</li>
		</ol>
</li>
		<li>地域内で FI 値測定値からバック グラウンド FI を減算します。修正付き測定を平均値で割ることによって正規化、背景修正 FI の photoactivation の前にまず 9 フレーム。ΔF/F = ((FI-FIb)/mean(FI1-9)-FI のb))。 注: グラフ ΔF/時間の関数として F。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
距離
	<ol>
<li>X と y を得るセンサー領域の中心の座標。<ol>
<li>X と y にセンサー領域の中心の座標がマスクされたセンサー領域を強調表示するを選択します。Photoactivation の領域が強調表示されます、分析を選択 |統計情報をマスク |エリアの中心と値をエクスポートします。</li>
		</ol>
</li>
		<li>X と y それぞれの時間ポイントの関心の蛍光プローブの座標。これは通常、手動または自動のいずれかの粒子追跡を実現します。<ol>
<li>X と y 座標、関心の蛍光プローブのマニュアル粒子追跡を選択し、時間をかけて興味の蛍光プローブをクリックします。すべての時間ポイントを追跡されている、分析を選択 |統計情報をマスク |エリアの中心と値をエクスポートします。</li>
		</ol>
</li>
		<li>興味の蛍光蛋白質と式を使用して各時間ポイント センサー領域の中心間の距離を計算する: 距離 = √ ((x2- x1)2+ (y2-y1)2)、2 y の x2に関心と x1 , y1の蛍光蛋白質の座標は、センサー領域の中心の座標。</li>
		<li>時間の関数として距離をグラフ化します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+structure+and+function+of+the+immunological+synapse.">Understanding the structure and function of the immunological synapse.</a> Cold Spring Harb.Perspect.Biol. 2, a002311 (2010).</li><li>Liu, X., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+Synapse+Formation:+Cell+Polarity+During+T+Cell-APC+Interaction.">Immunological Synapse Formation: Cell Polarity During T Cell-APC Interaction.</a> Cell Polarity 1. , 247-275 (2015).</li><li>Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+actin+polymerization+drives+T+cell+receptor-induced+spreading:+A+role+for+the+signal+transduction+adaptor+LAT.">Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: A role for the signal transduction adaptor LAT.</a> Immunity. 14, 315-329 (2001).</li><li>Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+Function+of+the+Immunological+Synapse+from+Studies+with+Supported+Planar+Bilayers.">Insights into Function of the Immunological Synapse from Studies with Supported Planar Bilayers.</a> Current topics in microbiology and immunology. 340, (2010).</li><li>Chauveau, A., Le Floc'h, A., Bantilan, N. S., Koretzky, G. a., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diacylglycerol+kinase+&#945;+establishes+T+cell+polarity+by+shaping+diacylglycerol+accumulation+at+the+immunological+synapse.">Diacylglycerol kinase &#945; establishes T cell polarity by shaping diacylglycerol accumulation at the immunological synapse.</a> Sci. Signal. 7, ra82 (2014).</li><li>Huse, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+Temporal+Dynamics+of+T+Cell+Receptor+Signaling+with+a+Photoactivatable+Agonist.">Spatial and Temporal Dynamics of T Cell Receptor Signaling with a Photoactivatable Agonist.</a> Immunity. 27, 76-88 (2007).</li><li>Quann, E. J., Merino, E., Furuta, T., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+diacylglycerol+drives+the+polarization+of+the+microtubule-organizing+center+in+T+cells.">Localized diacylglycerol drives the polarization of the microtubule-organizing center in T cells.</a> Nat Immunol. 10, 627-635 (2009).</li><li>Basu, R., Chen, Y., Quann, E. J., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+variable+hinge+region+of+novel+PKCs+determines+localization+to+distinct+regions+of+the+immunological+synapse.">The variable hinge region of novel PKCs determines localization to distinct regions of the immunological synapse.</a> PLoS One. 9, 1-8 (2014).</li><li>Liu, X., Kapoor, T. M., Chen, J. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics+of+T+cell+receptor+binding+to+peptide-MHC:+evidence+for+a+general+mechanism+of+molecular+scanning.">Thermodynamics of T cell receptor binding to peptide-MHC: evidence for a general mechanism of molecular scanning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 11446-11451 (1999).</li><li>Garboczi, D. N., Hung, D. T., Wiley, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA-A2-peptide+complexes:+refolding+and+crystallization+of+molecules+expressed+in+Escherichia+coli+and+complexed+with+single+antigenic+peptides.">HLA-A2-peptide complexes: refolding and crystallization of molecules expressed in Escherichia coli and complexed with single antigenic peptides.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 3429-3433 (1992).</li><li>Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+use+two+directionally+distinct+pathways+for+cytokine+secretion.">T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion.</a> Nat. Immunol. 7, 247-255 (2006).</li><li>Abeyweera, T. P., Merino, E., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+signaling+blocks+activating+receptor+clustering+and+induces+cytoskeletal+retraction+in+natural+killer+cells.">Inhibitory signaling blocks activating receptor clustering and induces cytoskeletal retraction in natural killer cells.</a> J. Cell Biol. 192, 675-690 (2011).</li><li>Nguyen Duc, T., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Generalizable+Platform+for+the+Photoactivation+of+Cell+Surface+Receptors.">A Generalizable Platform for the Photoactivation of Cell Surface Receptors.</a> ACS Chem. Biol. 10, 2435-2440 (2015).</li><li>Airan, R. D., Thompson, K. R., Fenno, L. E., Bernstein, H., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+precise+in+vivo+control+of+intracellular+signalling.">Temporally precise in vivo control of intracellular signalling.</a> Nature. 458, 1025-1029 (2009).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+chemokine+receptor+signal+and+T-cell+migration.">Optogenetic control of chemokine receptor signal and T-cell migration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111, 6371-6376 (2014).</li><li>Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+cell+signalling+using+a+light-switchable+protein+interaction.">Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction.</a> Nature. 461, 997-1001 (2009).</li><li>Guntas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+an+improved+light-induced+dimer+(iLID)+for+controlling+the+localization+and+activity+of+signaling+proteins.">Engineering an improved light-induced dimer (iLID) for controlling the localization and activity of signaling proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 112-117 (2015).</li><li>Wu, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+photoactivatable+Rac+controls+the+motility+of+living+cells.">A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells.</a> Nature. 461, 104-108 (2009).</li><li>Pathak, G. P., Vrana, J. D., Tucker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+cell+function+using+engineered+photoreceptors.">Optogenetic control of cell function using engineered photoreceptors.</a> Biol. cell/under auspices Eur. Cell Biol. Organ. 105, 59-72 (2014).</li><li>Grusch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporally+precise+activation+of+engineered+receptor+tyrosine+kinases+by+light.">Spatio-temporally precise activation of engineered receptor tyrosine kinases by light.</a> EMBO J. 33, 1713-1726 (2014).</li><li>Yi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+repositioning+in+T+cells+is+biphasic+and+driven+by+microtubule+end-on+capture-shrinkage.">Centrosome repositioning in T cells is biphasic and driven by microtubule end-on capture-shrinkage.</a> J. Cell Biol. 202, 779-792 (2013).</li></ol>

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近年では、光は細胞プロセスの時空制御の活性化のための優れたツールとして浮上しています。さまざまな方法論が開発されて、それぞれ関連する利点と欠点を持つ。固定化、細胞外リガンドの decaging に基づいて、ここでは、記載されているシステムは、迅速な細胞内局在、偏光のシグナリング応答の解析に最適です。このアプローチは、上記のように T 細胞では形成を調べるに適用されて...

T リンパ球 (T 細胞) 細胞表面 MHC のコンテキストに表示された抗原ペプチドを認識し、細胞性免疫の中心的な役割を再生します。TCR による抗原認識はナイーブ T 細胞の分化をドライブし、エフェクター集団による細胞傷害性とコミュニケーションの応答の配信を促進します。TCR の婚約は、細胞アーキテクチャの劇的な変化を誘導します。分以内に、T 細胞は抗原提示細胞 (APC) の免疫学的シナプス (IS)1,2として知られている偏光インターフェイスを形成側に gloms します。IS は、サイトカインや細胞傷害性 T リンパ球 (Ctl)、溶菌タンパク質 APC を破壊する場合の方向のリリースを有効にするエフェクター T 細胞の反応を増強します。
PMHC TCR 婚約は、最終的に堅牢なシナプス細胞骨格2の改造を促進する活性化 T 細胞 (LAT) のリンカーを含む複数のダウン ストリーム アダプター分子の迅速なリン酸化を誘導します。皮質アクチン フィラメント (アクチン) APC 表面上で広がっている T 細胞をドライブし、F アクチン集積は周縁と中心からの枯渇によって特徴付けられる環状の構造に解決します。F-アクチン リングの形成は微小管組織センター (脂質、T 細胞の中心体とも呼ばれます) の向きかえに密し、インタ フェースのセンターのすぐ下に位置します。両方のイベントは、初期の抗原認識の分内で発生し、それ以降のアクティブ化イベントとエフェクターの応答が発生する建築のコンテキストを確立します。
形成を研究、さまざまな研究機関は、APC は TCR リガンドの固定化を含むかまたはサポート自体が配位子3,4を含む脂質二分子膜ガラス表面で置き換えられますのアプローチを開発しました。T 細胞は、内部全反射蛍光顕微鏡 (TIRF)、共焦点顕微鏡、初期の T 細胞の活性化とは形成の高分解能解析を有効にするイメージを作成することができますこれらの表面上はのような連絡先を形成します。
これらの方法が完全に組み立てられたは優秀な可視化のため許可されていますが、信号の次 TCR:pMHC 結紮の多く発生してから数秒、TCR 活性化を正確に次のイベントのシーケンスを確認する努力を複雑.この問題を回避するために、活性型 pMHC が TCR 活性化5,6、7の時空間的制御を達成するために使用されている、photoactivation アプローチが開発されています。このシステムで T 細胞は TCR 紫外線 (UV) を照射するまでに非刺激は活性型 pMHC を含むガラス表面に添付されます。T 細胞の下にある表面の微小領域における紫外線照射は、T 細胞が認識できる刺激ゾーンを作成する photocage を削除します。その後主セルシグナ リング イベントと細胞骨格改造は、遺伝子にエンコードされた蛍光レポーターを使用してに監視されます。抗原ペプチド、蛾チトクロム c-88 103 (MCC) 及び卵白アルブミン257-264 (OVA) 提示されており、クラスとクラス II MHC-Ekのコンテキストで私 MHC H2 Kb、それぞれ、2 つの活性型バージョンされています。(図 1) を開発しました。これにより、両方の CD4 の解析+ T 細胞 MCC Ek (5 C を表現するために特定C7、2B4、またはと Tcr) および CD8+ T 細胞 (OT1 TCR を表現する) OVA H2 Kbの特定。
初期 TCR シグナリング手順の正確な動態を確立する、また偏光骨格改造5,を支配する分子経路を識別するために過去 10 年間、TCR の photoactivation とイメージングのアプローチに利用されています。6,7,8,9,10です。 たとえば、アッセイはその体を決定する際に尽力した APC に向かって方向転換が中心ですが脂質第 2 メッセンジャー ジアシルグリセロールキナーゼのローカライズされたグラデーションによって媒介されます。この方法論は T 細胞の機能の高解像度イメージング解析が要求される用途に貴重なことを続けることが予想されます。

<table><tbody><tr><td>Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>155361</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine hydrobromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td>Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine</td></tr><tr><td>EZ-Link NHS-Biotin</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>20217</td><td>Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine</td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>434301</td><td></td></tr><tr><td>BirA-500: BirA biotin-protein ligase standard reaction kit</td><td>Avidity</td><td>BirA500</td><td>Will be used to biotinylate proteins</td></tr><tr><td>Biotinylated Hb I-E&lt;sup&gt;K&amp;nbsp;&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td>For protein folding, see reference 6. For biotinylation, use BirA kit</td></tr><tr><td>Biotinylated NPE-MCC I-E&lt;sup&gt;K&amp;nbsp;&lt;/sup&gt;</td><td>Anaspec</td><td></td><td>Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) can be purchased from Anaspec</td></tr><tr><td>Biotinylated &amp;alpha;H2-K&lt;sup&gt;k&lt;/sup&gt; antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>553591</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated NPE-OVA H2-K&lt;sup&gt;b&lt;/sup&gt;</td><td>Anaspec</td><td></td><td>Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) can be purchased from Anaspec</td></tr><tr><td>Biotinylated KAVY H2-D&lt;sup&gt;b&lt;/sup&gt;&amp;nbsp;</td><td>Anaspec</td><td></td><td>Custom synthesized protein (KAVYDFATL) can be purchased from Anaspec</td></tr><tr><td>Biotinylated ICAM1&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>For protein folding, see reference in protocol. For biotinylation, use BirA kit</td></tr><tr><td>Hand held UV lamp</td><td>UVP</td><td>UVGL-25</td><td>Lamp is held &amp;lt; 1 cm from the sample.&amp;nbsp; 30 s of 365 light is sufficient for detectable decaging, 20 min for quantitative decaging.</td></tr><tr><td>Olympus IX-81 OMAC TIRF system.</td><td>Olympus</td><td></td><td>Additional information about the imaging system can be found in &lt;strong class=&quot;xfig&quot;&gt;Figure 6&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Mosaic digital diaphragm</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slidebook software</td><td>Intelligent Imaging Innovations</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

spatial and temporal control of t cell activation using a photoactivatable agonist

T リンパ球は、TCR 活性化の後数分以内に発生する急速な偏波伝達に従事します。これは免疫学のシナプスでは、T 細胞の活性化を調節し、エフェクターの応答を方向ターゲット ステレオタイプ化された細胞の接合部の形成を誘導します。これらのプロセスを効果的に勉強するには、高速、偏光応答をキャプチャに合ったイメージング アプローチが必要です。このプロトコルでは、活性型ペプチド主要組織適合複合体 (pMHC) 紫外線にさらされてまでに非刺激されるに基づいているそのようなシステムについて説明します。正確に TCR 活性化の時空間制御とイメージング内部全反射 (TIRF) によってそれに続く細胞応答の高解像度監視が可能ビデオ顕微鏡の実験中にこの試薬のターゲット decaging。このアプローチはまた遺伝学的および薬理学的摂動戦略と互換性があります。これにより免疫学のシナプスの根底にある偏光の骨格の形成に TCR シグナリング リンク明確の分子経路の組み立てのため。

Photoactivation とイメージングのアプローチは、観察と急速に、偏光のシグナリング応答の簡易定量化します。再現、その機能を説明するためにここでは、DAG の TCR による蓄積と中心体の向きかえの時空間相関を調べる実験。5 CC7 T 細胞芽球が蛍光レポーター遺伝子導入した: 蛋白質キナーゼ C θ からタンデム C1 ドメインを含む DAG バイオ GFP (C1 GFP) と RFP チューブリン中?...

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Spatial and Temporal Control of T Cell Activation Using a Photoactivatable Agonist

活性型アゴニストを用いた T 細胞活性化の空間的で、一時的なコントロール

このプロトコルでは、T リンパ球活性型ペプチド-MHC T 細胞活性化の正確な時空間制御を有効にするを使用してアクティブにするイメージング ベースの方法について説明します。

T lymphocytes engage in rapid, polarized signaling, occurring within minutes following TCR activation. This induces formation of the immunological ...

spatial-temporal-control-t-cell-activation-using-photoactivatable

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

6.2K ビュー.  Memorial Sloan-Kettering Cancer Center. このプロトコルでは、T リンパ球活性型ペプチド-MHC T 細胞活性化の正確な時空間制御を有効にするを使用してアクティブにするイメージング ベースの方法について説明します。

ビデオ: Spatial and Temporal Control of T Cell Activation Using a Photoactivatable Agonist

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular functions and events1, 2. Their spatiotemporally dynamic nature has been revealed by visualization of their activity and localization in real time3. In order to gain deeper understanding of their roles in diverse cellular functions at the molecular level, the next step should be perturbation of protein activities at a precise subcellular location and timing. 
To achieve this goal, we have developed a method for light-induced, spatio-temporally controlled activation of small GTPases by combining two techniques: (1) rapamycin-induced FKBP-FRB heterodimerization and (2) a photo-caging method of rapamycin. With the use of rapamycin-mediated FKBP-FRB heterodimerization, we have developed a method for rapidly inducible activation or inactivation of small GTPases including Rac4, Cdc424, RhoA4 and Ras5, in which rapamycin induces translocation of FKBP-fused GTPases, or their activators, to the plasma membrane where FRB is anchored. For coupling with this heterodimerization system, we have also developed a photo-caging system of rapamycin analogs. A photo-caged compound is a small molecule whose activity is suppressed with a photocleavable protecting group known as a caging group. To suppress heterodimerization activity completely, we designed a caged rapamycin that is tethered to a macromolecule such that the resulting large complex cannot cross the plasma membrane, leading to virtually no background activity as a chemical dimerizer inside cells6. Figure 1 illustrates a scheme of our system. With the combination of these two systems, we locally recruited a Rac activator to the plasma membrane on a timescale of seconds and achieved light-induced Rac activation at the subcellular level6.

A method for spatio-temporal control of small GTPase activity by light is described. This method is based on rapamycin-induced FKBP-FRB heterodimerization and photo-caging systems. Optimization of light-irradiation enables the spatio-temporally controlled activation of small GTPases at the subcellular level.

生きた細胞の細胞内レベルでの秒のタイムスケールの上に小さなGTPase活性の時空間操作

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

生物工学

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling pathway is one of such essential molecular machinery for cell-to-cell communications, which plays key roles in normal development of embryos. This pathway involves a cell-to-cell transfer of oscillatory information with ultradian rhythms, but despite the progress in molecular biology techniques, it has been challenging to elucidate the impact of multicellular interactions on oscillatory gene dynamics. Here, we present a protocol that permits optogenetic control and live monitoring of gene expression patterns in a precise temporal manner. This method successfully revealed that intracellular and intercellular periodic inputs of Notch signaling entrain intrinsic oscillations by frequency tuning and phase shifting at the single-cell resolution. This approach is applicable to the analysis of the dynamic features of various signaling pathways, providing a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Here, we present a protocol to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information by optogenetic control and live monitoring of gene expression. This approach provides a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

制御、細胞間相互作用における遺伝子発現パターンを分析して光遺伝学的方法

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

遺伝学

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex (pMHC) proteins expressed on the surface of antigen presenting cells (APCs). The TCR complex is composed of the ligand binding TCR&alpha;&beta; heterodimer that associates non-covalently with CD3 dimers (the &#949;&delta; and &#949;&gamma; heterodimers and the &zeta;&zeta; homodimer)1. Upon engagement of the receptor, the CD3 &zeta; chains are phosphorylated by the Src family kinase, Lck. This leads to the recruitment of the Syk family kinase, Zap70, which is then phosphorylated and activated by Lck. After that, Zap70 phosphorylates the adapter proteins LAT and SLP76, initiating the formation of the proximal signaling complex containing a large number of different signaling molecules2. 
The formation of this complex eventually results in calcium and Ras-dependent transcription factor activation and the consequent initiation of a complex series of gene expression programs that give rise to T cell differentiation2. TCR signals (and the resulting state of differentiation) are modulated by many other factors, including antigen potency and crosstalk with co-stimulatory/co-inhibitory, chemokine, and cytokine receptors 3-4. Studying the spatial and temporal organization of the proximal signaling complex under various stimulation conditions is, therefore, key to understanding the TCR signaling pathway as well as its regulation by other signaling pathways.
One very useful model system to study signaling initiated by the TCR at the plasma membrane in T cells is glass-supported lipid bilayers, as described previously5-6. They can be utilized to present antigenic pMHC complexes, adhesion, and co-stimulatory molecules to T cells-serving as artificial APCs. By imaging the T cells interacting with the lipid bilayer using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), we can restrict the excitation to within 100 nm of the space between the glass and the cell surface 7-8. This allows us to image primarily the signaling events occurring at the plasma membrane. As we are interested in imaging the recruitment of signaling proteins to the TCR complex, we describe a two-camera TIRF imaging system wherein the TCR, labeled with fluorescent Fab (fragment antigen binding) fragments of the H57 antibody (purified from hybridoma H57-597, ATCC, ATCC Number:HB-218) which is specific for TCR&beta;, and signaling proteins, tagged with GFP, may be imaged simultaneously and in real time. This strategy is necessary due to the highly dynamic nature of both the T cells and of the signaling events that are occurring at the TCR. This imaging modality has allowed researchers to image single ligands 9-11 as well as recruitment of signaling molecules to activated receptors and is an excellent system to study biochemistry in-situ12-16.

The compartmentalization of proteins either within the plasma membrane or into intracellular locations is one regulatory mechanism that can greatly influence signaling outcomes; hence, to understand signaling it is important to study the spatial and temporal behavior of the proteins involved. We describe here a TIRF microscopy based system to study signal transduction in T cells, but is broadly applicable.

TCRとそれに関連するシグナル伝達タンパク質のリアルタイムの同時イメージングのための全反射顕微鏡法

Signaling is initiated through the T Cell Receptor (TCR) when it is engaged by antigenic peptide fragments bound by Major Histocompatibility Complex ...

免疫・感染学

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

複合体形成シグナリングT細胞のリアルタイムのライブイメージング

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

ライブゼブラフィッシュ胚における二光子ベースの光活性化

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

生物学

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

炎症真皮における撮像CD4 T細胞間質への移行

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

ニューロンに遺伝的にコードされた非天然アミノ酸を用いた神経タンパク質の光制御

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

神経科学

Use of Single Chain MHC Technology to Investigate Co-agonism in Human CD8+ T Cell Activation

Non-stimulatory self peptide MHC (pMHC) complexes do not induce T cell activation and effector functions, but can enhance T cell responses to agonist pMHC, through a process termed co-agonism. This protocol describes an experimental system to investigate co-agonism during human CD8+ T cell activation by expressing human MHC class I molecules presenting pre-determined peptides as single polypeptides (single chain MHC) in a xenogeneic cell line. We expressed single chain MHCs under conditions where low levels of agonist single chain p-MHC complexes and high levels of non-stimulatory single chain p-MHC complexes were expressed. Use of this experimental system allowed us to compare CD8+ T cell responses to agonist pMHC in the presence or absence of non-stimulatory pMHC. The protocol describes cell line transfection with single chain MHC constructs, generation of stable cell lines, culture of hepatitis B virus-specific human CD8+ T cells and T cell activation experiments simultaneously quantifying cytokine production and degranulation. The presented methods can be used for research on different aspects of CD8+ T cell activation in human T cell systems with known peptide MHC specificity.

This protocol describes the use of single chain MHC class I complexes to investigate molecular interactions in human CD8+ T cell activation: generation of engineered antigen presenting cells expressing single chain constructs, culture of human CD8+ T cell clone and T cell activation experiments.

人間 cd8 T 細胞活性化における Co 作動を調査する単一のチェーン MHC 技術の使用

Non-stimulatory self peptide MHC (pMHC) complexes do not induce T cell activation and effector functions, but can enhance T cell responses to agonist ...

Interrogating Individual Autoreactive Germinal Centers by Photoactivation in a Mixed Chimeric Model of Autoimmunity

Autoimmune diseases present a significant health burden. Fundamental questions regarding the development and progression of autoimmune disease remain unanswered. One requirement for advancements in our understanding of the underlying disease mechanisms and cellular dynamics is the precise coupling of the microanatomical location of cell subsets with downstream molecular or functional analyses; a goal that has traditionally been difficult to achieve. The development of stable photoactivatable biological fluorophores and their integration into reporter strains has recently enabled precise microanatomical labeling and tracking of cellular subsets in murine models. Here, we describe how the ability to analyze autoreactive lymphocytes from single germinal centers may help to provide novel insights into autoimmunity, using the combination of a novel chimeric model of autoimmunity with a photoactivatable reporter as an example. We demonstrate a procedure for generating mixed chimeras with spontaneous autoreactive germinal centers populated by lymphocytes carrying a photoactivatable green fluorescent protein reporter. Using in vivo labeling strategies, single germinal centers can be visualized in explanted lymphoid tissues and their cellular constituents photoactivated by two-photon microscopy. Photoactivated lymphocytes from single germinal centers can then be analyzed or sorted flow cytometrically, as single cells or in bulk, and may be subjected to additional downstream molecular and functional analyses. This approach may directly be applied to provide renewed insights in the field of autoimmunity, but the procedure for generating bone marrow chimeras and the photoactivation procedure may additionally find broad application in studies of infectious diseases and tumor metastases.

This protocol describes the generation of mixed murine bone marrow chimeras with spontaneous autoimmune germinal centers, in which autoreactive lymphocytes carry a photoactivatable green fluorescent protein (PA-GFP) reporter. This provides the ability to link cellular location in tissues with downstream molecular and functional analyses.

自己免疫の混合キメラ モデルの光活性化によって個々 の自己反応性濾胞を尋問

Autoimmune diseases present a significant health burden. Fundamental questions regarding the development and progression of autoimmune disease remain ...

<meta charset="utf8"></head><body>光制御アロステリックスイッチを用いた酵素活性の光遺伝学的制御

Spatiotemporal Control of Protein Activity through Optogenetic Allosteric Regulation

Optogenetics offers the potential for mimicking complex spatiotemporal control of enzyme activity down to a subcellular resolution. However, most optogenetic approaches often face significant challenges in integrating multiple capabilities in a single tool applicable to a wide range of target proteins. Achieving precise control over ON/OFF kinetics, ensuring minimum leakiness in the dark, and demonstrating efficient performance in mammalian cells with subcellular precision are some of the most common challenges faced in this field. A promising solution lies in the application of rationally designed light-sensitive domains to allosterically control protein activity. Using that strategy, we generated an optogenetic method combining all the desired features. The approach involves the incorporation of the Light-regulated allosteric switch module (LightR) in the target protein to regulate enzyme activity using blue (465 nm) light. The LightR domain is generated by linking two Vivid (VVD) photoreceptor domains, creating a light-sensitive clamp that can be incorporated into a small flexible loop within the catalytic domain of an enzyme. In its dark state, LightR clamp is open, thus distorting the enzyme&#39;s catalytic domain and inactivating it. Upon exposure to blue light, the LightR domain closes and restores the catalytic domain&#39;s structure and enzyme activity. In this manuscript, we discuss design strategies&#160;to generate a light-regulated protein kinase and demonstrate its control by blue light, reversibility, kinetics, and precise regulation at the subcellular level, enabling tight spatiotemporal precision. Utilizing Src tyrosine kinase as a model, we showcase a protocol for effectively regulating LightR-Src kinase activity. We also demonstrate LightR applicability across different enzyme classes, expanding the utility of the tool system in addressing mechanistic questions of signaling pathways in different diseases.

<meta charset="utf8"></head><body>光遺伝学的アロステリック制御によるタンパク質活性の時空間制御

This protocol describes the application of an engineered blue-light-activated allosteric switch (LightR) domain for reversible spatiotemporal control of protein activity. Utilizing Src tyrosine kinase as a model, this study offers an elaborate protocol for developing and characterizing light-regulated Src (LightR-Src). It demonstrates the versatility of this approach across enzyme classes.

活性型アゴニストを用いた T 細胞活性化の空間的で、一時的なコントロール

要約

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生きた細胞の細胞内レベルでの秒のタイムスケールの上に小さなGTPase活性の時空間操作

制御、細胞間相互作用における遺伝子発現パターンを分析して光遺伝学的方法

TCRとそれに関連するシグナル伝達タンパク質のリアルタイムの同時イメージングのための全反射顕微鏡法

複合体形成シグナリングT細胞のリアルタイムのライブイメージング

ライブゼブラフィッシュ胚における二光子ベースの光活性化

炎症真皮における撮像CD4 T細胞間質への移行

ニューロンに遺伝的にコードされた非天然アミノ酸を用いた神経タンパク質の光制御

人間 cd8 T 細胞活性化における Co 作動を調査する単一のチェーン MHC 技術の使用

自己免疫の混合キメラモデルの光活性化によって個々の自己反応性濾胞を尋問

光遺伝学的アロステリック制御によるタンパク質活性の時空間制御

活性型アゴニストを用いた T 細胞活性化の空間的で、一時的なコントロール

要約

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生きた細胞の細胞内レベルでの秒のタイムスケールの上に小さなGTPase活性の時空間操作

制御、細胞間相互作用における遺伝子発現パターンを分析して光遺伝学的方法

TCRとそれに関連するシグナル伝達タンパク質のリアルタイムの同時イメージングのための全反射顕微鏡法

複合体形成シグナリングT細胞のリアルタイムのライブイメージング

ライブゼブラフィッシュ胚における二光子ベースの光活性化

炎症真皮における撮像CD4 T細胞間質への移行

ニューロンに遺伝的にコードされた非天然アミノ酸を用いた神経タンパク質の光制御

人間 cd8 T 細胞活性化における Co 作動を調査する単一のチェーン MHC 技術の使用

自己免疫の混合キメラ モデルの光活性化によって個々 の自己反応性濾胞を尋問

光遺伝学的アロステリック制御によるタンパク質活性の時空間制御

自己免疫の混合キメラモデルの光活性化によって個々の自己反応性濾胞を尋問