パーキンソン病の診断は、実質的なニグラのニューロンのほとんどがすでに失われている病気の過程で後に現れる運動関与の臨床的徴候に依然として依存している。このプロトコルは、皮膚生検による真皮神経分析を可能にし、それは、疾患の潜在的な新しいバイオマーカーを表し、臨床試験で使用される。皮膚生検は、病理になりやすい末梢神経組織の分析を可能にする、容易に評価可能で侵襲性のない処置である。
皮膚生検によるαシヌクレイン凝集体の検出は、潜在的な治癒が最も効果的である場合、おそらく初期段階で診断目的に使用することができる。同じ患者におけるフォローアップ皮膚生検は、ヒト皮膚神経系に広がるαシヌクレイン集合体の時間および特別な経過解析を可能にする。これらは病気の病因に光を当てることができます。
この手順を開始するには、テキスト プロトコルの表 1 に示すように、新しい PLP 固定ソリューションを準備します。皮膚生検を採取した直後に、10ミリリットルの固定液を含むチューブに沈下する。摂氏4度で一晩インキュベートします。
翌日、ヒュームフードでPLP固定剤をそっと取り除きます。同じチューブで、生検をそれぞれ5分間3回洗浄し、洗浄ごとに0.1モルソレンセンの溶液を5ミリリットル使用します。ソレンセンの溶液を捨て、5ミリリットルの凍結保護液を加える。
摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、クリオトームで切り取る場合は、1週間以内に生検を摂氏4度で保存します。まず、クライオトームをマイナス20度に設定します。
クライオオールを取り、クライオ埋め込み媒体でそれを埋めます。ピンセットを使用して、クリオムノルドの底に平行な長手軸を持つクリオ埋め込み培地に生検を浸します。液体窒素で試料を凍結し、正しい配向で生検を含む凍結埋め込み培地の固体立方体を得た。
サンプルをクライオスタットに入れ、30分待って生検が順応するのを許す。その後、クライオスタットのサンプルを固定し、50マイクロメートルのセクションに切断します。小さなブラシを使用して、各ウェルに200マイクロリットルの不凍液を含む96ウェルプレートにクライオセクションを移します。
その後、マイナス20度でプレートを保管してください。まず、新鮮な96ウェルプレートの井戸の一部に100マイクロリットルの洗浄液を充填します。分析するセクションを保管プレートから洗浄液を含むセクションに移します。
洗浄液中のセクションを室温で10分間放置します。次に、各セクションを同じ洗浄液を含む空の井戸に移し、洗浄を繰り返す。次に、洗浄液をセクションに加え、100マイクロリットルのブロッキング溶液を含む新しいウェルに移します。
室温で90分以上、最大4時間インキュベートします。一次抗体、抗PGP9.5および抗5G4を働く溶液で希釈する。一次抗体の100マイクロリットルの作動溶液を含む新しいウェルに切片を移し、室温で一晩インキュベートする。
翌日、先に述べたように洗浄液を含むウェルで切片を洗う。二次抗体を希釈し、ヤギ抗ウサギはPGP9.5を検出し、ヤギ抗マウスは5G4を検出し、働く溶液中で。洗浄した切片を、二次抗体の働く溶液の100マイクロリットルを含む新しいウェルに移す。
二次抗体と共役したフルオロフォアの漂白を避けるために、アルミニウム箔でプレートを覆い、室温で90分間インキュベートします。この後、先に述べたように洗浄液中のセクションを2回洗う。洗浄した切片を、室温で5分間、100マイクロリットルのDAPIを含む新しいウェルに移します。
先に述べたように洗浄液でセクションを2回洗う。次に、正しい位置にスライド上のセクションを取り付け、誤った折り畳みを回避します。スライドに取り付け媒体を数滴追加し、カバースリップでセクションを覆います。
スライドを一晩乾燥させます。翌日、スライドを摂氏4度の適切なボックスに保管し、光の露出を避けるようにします。反転蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して、切片を見る。
顕微鏡に接続されたカメラで画像を取得します。次に、蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して、テキストプロトコルに概説されているように、空間分布と信号の強度の観点から正の信号を分析します。記載された方法に従って、5G4抗体で標識されたαシヌクレイン凝集体は、PD患者の真皮神経筋膜内自律神経構造で検出される。
αシヌクレイン沈着物の形態は、真皮神経の軸索に沿った点線信号として現れる。3つの解剖学的部位における19のPD患者および17の皮膚生検における17の対照におけるこのプロトコルの代表的な使用は、5G4が健康なコントロールと比較して81%の感受性および86%の特異性を有することを示す。リン酸化アルファシヌクレインは56%の感度を有し、100%5G4の特異性を有し、リン酸化されたαシヌクレイン陽性沈着物は主に汗腺の周りに見られるが、筋肉アレクターピリ、小血管、および皮下および皮膚神経叢にも見られるが、エピ皮内神経線維では見なされていない。
一般に、汗腺内の内腔は、5G4またはリン酸化されたαシヌクレイン陽性と誤って解釈され得る非特異的なシグナルを観察することができる。このタイプのシグナルは、点線、球状であり、一次および二次抗体のない技術的制御で示されているように、おそらくイントラミナル自己蛍光材料によるものである。形態学的に細長い神経線維をマークするPGP9.5との共局在化は、正しい信号を識別するのに役立ちます。
したがって、5G4シグナルの特異性は、軸索マーカーを用いた二重免疫染色によって高くなる。良質な免疫蛍光染色を行い、蛍光シグナルの信頼性の高い解釈のためには、生検の正確な固定化が必要です。固定剤が正しく調製されていない場合、または過剰固定が発生した場合、結果は、真皮表皮接合部を横切る神経線維の信号を隠すか、または主要な真皮構造を内面化する高い自己蛍光になります。
この手順の最も重要なステップは、組織の固定です。自己蛍光と特定のシグナルを避けるために、PLP固定液のpH、およびインキュベーションのタイミングに注意してください。
