파킨슨 병의 진단은 여전히 실질적인 니그라의 뉴런의 대부분이 이미 손실 될 때 질병의 과정에서 나중에 나타나는 운동 참여의 임상 징후에 의존합니다. 이 프로토콜은 질병의 잠재적인 새로운 biomarker를 나타내는 피부 생검에 의한 진피 신경 분석을 임상 시험에서 사용할 수 있게 합니다. 피부 생검은 병리학에 수그리는 말초 신경 조직의 분석을 허용하는 쉽게 평가할 수 있는, 침략적이지 않은 절차입니다.
알파 synuclein 피부 생검에 의한 검출은 잠재적인 치료가 가장 효과적인 때, 아마 초기 단계에서 진단 목적을 위해 사용될 수 있습니다. 같은 환자에 있는 후속 피부 생검은 인간 적인 피부 신경계에 퍼지는 알파 synuclein 집계의 시간 및 특별한 과정 분석을 허용합니다. 이들은 질병의 병기 발생에 빛을 비출 수 있습니다.
이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜 중 표 하나에 설명된 대로 새 PLP 고정 솔루션을 준비합니다. 피부 생검을 수집 한 직후 고정 용액의 10 밀리리터가 들어있는 튜브에 담급하십시오. 섭씨 4도에서 하룻밤 을 배양하십시오.
다음 날, 연기 후드에, PLP 고정을 부드럽게 제거합니다. 같은 튜브에서 생검을 각각 5분 동안 3회 세척하여 각 세척에 대해 0.1 개의 어금니 소렌슨의 용액 5 밀리리터를 사용하십시오. 소렌슨의 용액을 폐기하고 5밀리리터의 냉동 보호용 솔루션을 추가합니다.
섭씨 4도에서 하룻밤 을 배양하십시오. 다음 날, 극저온으로 절단이 1 주일 이내에 수행 될 경우 4 섭씨에 생검을 저장합니다. 먼저 극저온을 영하 20도로 설정합니다.
극저온을 가지고 극저온 포함 매체로 채웁니다. 핀셋을 사용하여, 극저온 의 바닥에 평행 세로 축으로, 극저온 포함 매체에 생검을 담급. 스냅은 액체 질소로 샘플을 동결하고, 올바른 방향으로 생검을 포함하는 극저온 염기질의 고체 큐브를 얻습니다.
샘플을 냉동에 넣고 생검이 적응할 수 있도록 30 분 동안 기다립니다. 그런 다음 저온 측정기의 샘플을 수정하고 50 마이크로미터 섹션으로 자른다. 작은 브러시를 사용하여 저온 섹션을 각 우물에 200 마이크로리터의 부동액용을 포함하는 96웰 플레이트로 옮춥니다.
그 후, 접시를 영하 20도에 보관하십시오. 우선, 신선한 96웰 플레이트의 우물 중 일부를 100 마이크로리터의 세척 용액으로 채우도록 하십시오. 저장 플레이트에서 세척 용액을 포함하는 섹션으로 옮기는 섹션.
실온에서 10 분 동안 세척 용액에 섹션을 둡니다. 그런 다음 각 섹션을 동일한 세척 용액을 포함하는 빈 우물로 옮기고 세척을 반복합니다. 다음으로, 섹션에 세척 솔루션을 추가하고 차단 용액 100 마이크로 리터를 포함하는 새로운 우물로 전송합니다.
실온에서 최소 90분, 최대 4시간 동안 배양합니다. 일차 항체, 안티 PGP9.5 및 항-5G4를 작업 용액에서 희석시. 1차 항체의 작동 용액의 100 마이크로리터를 포함하는 새로운 우물로 섹션을 옮기고, 실온에서 하룻밤 동안 배양한다.
다음 날, 이전에 설명한 대로 세척용액을 함유한 우물의 섹션을 세척한다. 작업 용액에서 PGP9.5 및 염소 항마우스를 검출하기 위해 이차 항체, 염소 안티래빗을 희석한다. 세척된 부분을 이차 항체의 작동 용액 100마이크로리터를 포함하는 새로운 우물로 옮는다.
알루미늄 호일로 접시를 덮고 이차 항체로 공칭된 플루오로포어의 표백을 피하고 실온에서 90분 동안 배양합니다. 그 후, 앞에서 설명한 대로 세척용액으로 2회 세척한다. 실온에서 5분 동안 DAPI 100 마이크로리터가 포함된 세척된 섹션을 새로운 우물로 옮겨 넣습니다.
앞에서 설명한 대로 세척 용액으로 섹션을 두 번 세척하십시오. 그런 다음 슬라이드에 섹션을 올바른 위치에 장착하여 잘못된 접이식을 피합니다. 슬라이드에 장착 매체를 몇 방울 더 추가하고 커버 슬립으로 섹션을 덮습니다.
슬라이드가 하룻밤 동안 건조하게 하십시오. 다음 날, 슬라이드를 섭씨 4도에 적절한 상자에 보관하여 빛 노출을 방지합니다. 반전형 형광 현미경 또는 공초점 현미경을 사용하여 섹션을 봅니다.
현미경에 연결된 카메라로 이미지를 획득합니다. 그런 다음, 형광 현미경 또는 공초점 현미경을 사용하여 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 신호의 공간 분포 및 강도 측면에서 섹션에서 양양성 신호를 분석한다. 설명된 방법에 따라, 5G4 항체로 표지된 알파 시뉴클레인 응집체는 PD 환자의 내부 직속 구조인 진피 신경 매심에서 검출된다.
알파 synuclein 예금의 형태는 진피 신경의 축삭을 따라 점선 신호로 나타납니다. 이 프로토콜을 대표로 사용하는 것은 19명의 PD 환자및 3개의 해부학적인 사이트에 있는 피부 생검에 있는 17개의 통제가 건강한 통제에 비교될 때 81%의 감도 및 86%의 특이성을 가지고 있다는 것을 보여줍니다. 인광 알파 시뉴클레인은 56%의 민감도를 가지며, 100%5G4의 특이성 및 인포레이트 알파 시뉴클레인 양성 침전물은 주로 땀샘 주변에서 발견되지만, 근육 아레토르 필리, 작은 혈관, 피및 진피 플렉서스에서 발견되지만, 결코 피피연성 신경 섬유섬유에 들어가지 않는다.
일반적으로 땀샘 내 루멘 내에서, 5G4 또는 인포리드 알파 synuclein 양성으로 잘못 해석될 수 있는 비특이적 신호를 관찰할 수 있다. 이러한 유형의 신호는 점선, 구형이며, 1차 및 이차 항체가 없는 기술적 제어에서 입증된 바와 같이 장루 내 자가형 물질때문일 수 있습니다. 형태학적으로 필라멘트및 길쭉한 신경 섬유를 표시하는 PGP9.5와의 공존은 올바른 신호를 식별하는 데 도움이됩니다.
따라서, 5G4 신호의 특이성은 축산 마커를 가진 이중 면역염색에 의해 높게 증가된다. 생검의 정확한 고정은 양질의 면역 형광 염색을 생성하고 형광 신호의 신뢰할 수있는 해석을 위해 필요합니다. 고정제가 올바르게 준비되지 않았거나 과다 고정이 발생한 경우, 그 결과는 진피 표피 접합을 가로지르는 신경 섬유의 신호를 가하거나 주요 진피 구조를 내면으로 가리는 높은 자동 형광이 될 것입니다.
이 절차의 가장 중요한 단계는 조직 고정입니다. PLP 고정 솔루션의 pH, 및 인큐베이션타이밍에 주의를 기울여 자동 불발성과 특정 신호를 피하십시오.
