このプロトコルは、非線形顕微鏡に興味を持つ科学者が、刺激されたラマン散乱に基づく顕微鏡の主要な構成要素、セットアップ、およびアライメント手順を理解するのに役立ちます。SRS顕微鏡の主な利点は、振動コントラストに基づいてラベルフリーイメージングを実行し、数秒で画像を取得する能力です。SRS顕微鏡は、細胞や細胞アーキテクチャの基本である脂質などの複雑な生物学的構造の研究を特に新たな高みにラベルフリーイメージングしました。
SRS信号は、プローブビームの強度の小さな変化として検出され、ノイズによって破損する可能性があります。したがって、正確な符号が重要です。まず、OPOとチタンサファイアレーザービームを顕微鏡に合わせて調整します。
次に、レーザービーム位置センサーの検出器を、二色鏡1とミラー6の間の2つの位置に配置します。最初の位置は二色性鏡1の近くに位置し、2番目の位置はミラー6に近い。位置ごとに、センサーを使用して OPO ビームの X 座標と Y 座標を検出します。
重要なのは、チタンサファイアレーザービームのX座標とY座標が、センサーの検出器の両方の位置で同じOPOであることを確認することです。一部の位置で座標が一致しない場合は、隣接するミラーの傾きを調整して補正します。同じ手順に従って、ミラーの6と7の間のパスのOPOに関してチタンサファイアビーム位置を整列させます。
ミラー6と7の間のフリップフロップマウントに追加のミラーを取り付け、ミラーのマウントを反転してビームを自動調整器に向ける。自動調整器コントローラの電源を入れ、制御するコンピュータでソフトウェアアプリケーションを起動し、オートコレータのビーム距離調整ネジを通常位置の8.35ミリメートルに設定します。次に、チタンサファイアビームを停止し、追加のミラーからオートコレータの入力ミラーにOPOビームを放出して投影します。
ここに示すように、レーザーパルス信号を最大にするために入力ミラーを調整してみてください。次に、OPOビームを停止し、フリップフロップマウントミラーから入力ミラーにオートコレータにチタンサファイアビームを放出して投影します。ここに示す自動調整器信号が得られるまで、最適なビーム調整を繰り返します。
次に、ビーム距離調整ネジを、7.30ミリメートルの十字位置に設定します。両方の梁を解放し、遅延ラインをスキャンして 2 つの梁をオーバーラップします。ここに示すように、得られたクロス相関信号を得る。
次に、フリップフロップマウントミラーを反転して、ビームがミラー7と顕微鏡のスキャンヘッドに到達できるようにします。コンデンサーを取り外し、エスケープボタンを使用して60倍の主観レンズを一時的に引き込みます。その後、ノーズピースを回転させて、60倍の主観レンズを光学路から移動させます。
次に、外部機械マウントを用いて検出器を顕微鏡の上部に取り付ける。50オームローパスフィルタを介して検出器の出力をオシロスコープに接続します。次に、スキャナーヘッドを制御するプロセッサの電源を入れ、OPOビームを顕微鏡のスキャナーヘッドに投影します。
OPO信号を監視し、XY変換器を使用して検出器で測定された電力を最大にします。次に、OPOレーザーからチタンサファイアレーザーにビームを切り替え、チタンサファイアレーザーの信号も得られるかどうかを確認します。これは、両方の梁が適切に整列していることを示します。
60x主観を導入するために、鼻片を後ろに回転させることでビームアライメントを完成。次に、顕微鏡の再焦点ボタンを使用して、最終的に60倍の顕微鏡対物レンズにフォーカスを取り戻します。最後に、サンプルに触れたり邪魔したりすることなく、凝縮器の代わりに40倍の倍率で目的を置きます。
顕微鏡前に測定したチタンサファイアとOPOレーザーのパワーを、両方のビームで30ミリワットに設定します。そして、OPOレーザーの波長を、前の値に対して、ポンプとプローブがビーズの振動周波数と共振しないように設定する。次に、両方のビームを解放し、顕微鏡に入るようにします。
スキャン遅延ラインのコンピュータ化されたトランスレータを実行し、遅延線の各位置に対してロックインアンプを使用して測定された強度を記録します。遅延行スキャンが完了するまで待ちます。今度は、OPOの波長を1076ナノメートルに戻し、ポンプとプローブがビーズの振動周波数と共振するようにします。
スキャン遅延ラインのコンピュータ化されたトランスレータを実行し、遅延行のスキャンが完了するまで待ちます。最後に、得られた重なりビーム位置と、刺激されたラマン散乱画像の次の取得のための遅延線を設定する。ビームの空間同期を最適化するには、まずチタンサファイアビームを停止し、OPO電力を8ミリワットに減らすことから始めます。
次に、検出器の読み出しをデータ取得カードに接続します。顕微鏡の走査コンソールと一緒にデータ収集プログラムを実行します。完了したら、ファイルを保存し、データを処理して、ここに示すような画像を取得します。
次に、OPOビームを停止し、チタンサファイアの電力を2.5〜4.5ミリワットに減らします。データ取得カードを使用して、検知器をロックインアンプと読み出しに接続します。次に、顕微鏡走査コンソールとともにデータ収集プログラムを再度実行する。
完了したら、ファイルを保存し、データを処理して、ここに示すような画像を取得します。40x目的とフォトダイオードの間にフィルターのスタックを導入して、ポンプパルスを除去し、ストーク信号のみを取得します。次に、ポンプ信号を8ミリワットの焦点を合わせて810ナノメートルに設定します。
プローブ信号を8ミリワットの同じ焦点を合わせる力で1076ナノメートルに設定し、3054逆センチメートルのラマンシフトを持つポリスチレンの典型的な炭素水素結合を調査します。データ取得カードに、ロックインアンプとロックインアンプの読み出しを使用して検出器を接続します。最後に、顕微鏡プログラムでピクセル形式と取得時間を設定し、それをデータ取得システムと実行し、それが完了したらマトリックスファイルを保存します。
サンプルの単一点からの測定例をここに示します。ビームが時間や空間で重なっていない場合、得られた結果は、ロックイン増幅器で測定される信号の振幅がゼロである、共振をオフにします。ただし、このシグナルの位相は負の値と正の値の間でジャンプします。
ビームが空間で重なっている場合、ビームが完全に重なっているときに信号が増えて最大に達し、位相はビームが重なっている間に固定値を達成し始めます。透過画像では、単一のビームが使用され、サンプルからの送信されたビーム強度はフォトダイオードによって測定されます。左はOPOを用いて伝送画像を取得し、右側にはチタンサファイアを用いて伝送画像を取得した。
SRS画像の典型的な例をここに示し、直径3マイクロメートルのポリスチレンビーズのラベルフリー画像が報告されています。SRS顕微鏡に基づいて、高品質の画像を得るためには、顕微鏡のアライメントが重要です。したがって、プロトコル内で示された全てのステップは注意深く行わなければならない。
