この作品は、NSF賞DBI 0852891によって賄われていた。本研究の一部は、協力協定第PHY0120999の下、カリフォルニア、デービスの大学によって管理されるバイオフォトニクス科学技術、指定されたNSF科学技術センターセンターによって資金を供給された。

1。いくつかの注意は、このシステム内でラマンサンプルを準備して置くことに注意する必要があります。 <ol><li>システムは通常、非常に短い作動距離を持つ非常に高開口数の目標を使用しているため、サンプルはカバースリップ上に配置されます。生物学的サンプルは、典型的にAttofluorセル室（Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州）でマウントされている第1の厚さのカバースリップ上に配置されています。 </li><li>特に液体試料、ヒトへの毒性それらは、シリコンエポキシの手段により、開口部に接合カバースリップの小さなガラスの瓶の中に配置されます。ボトルは、測定のために反転されます。 </li><li>私たちのシステムは、ポンプと信号パルスの正確なタイミングに依存するため、我々は客観的に上下に変換する私たちの顕微鏡の従来のフォーカス調整を、使用しないように制限されます。これは私たちのシステムからの光路を追加し、減算。その代わりに、我々は独自の独立したフォーカス制御を持っている顕微鏡のステージの上部に取り付けられた第2段階で我々のサンプルを配置。 </li></ol> 2。タイムゲートのラマンスペクトルを取るために、励起ビームが適切に準備する必要があります。 <ol><li> Sapphレーザー（カメレオン、コヒーレントシステム、サンタクララ、カリフォルニア州）：我々は、2.4 WチューナブルパルスTiから新たな光で始まります。 80 MHzのパルス列の各パルスのエネルギーの30ニュージャージー州を持っている、140 fsの時間幅を持って、と〜6nmのスペクトル帯域幅を持つ808 nmの中心とするスペクトルを有する。 </li><li>レーザ共振器を再入力から後方反射を防ぐために、光は、ファラデーアイソレータを介して渡されます。ファラデーアイソレータの前に置かれた半波長板は、システムに送信された総電力の連続同調することができます。 </li><li> 6nmのは、ほとんどのラマンモードを解決するには余りにも広い帯域幅であるため、ビームは808nmのを中心とする非常に狭い（0.8 nmのFWHM、アンドーバーコーポレーション、セーラム、ニューハンプシャー州）バンドパスフィルタを介して送信されます。 </li><li>光はその後、808 nmから404 nmの波長を半減さを5mmβ-バリウムホウ酸（BBO）結晶（CASIX、福州、福建省、PR中国）に色消し（F = 100 mm）と焦点を当てています。 BBO結晶は、先端とチルトのコントロールとマウントで配置され、また、翻訳の段階に搭載されている。波長変換の効率を最大化するために、結晶がダブレットの焦点について正確​​に対称に配置され、その結晶軸は、入射ビームの偏光に揃えられている必要があります。 </li><li>波長変換の効率は偏光に依存するので、サンプルに送られた光の量の制御は、ファラデーアイソレータ秒後に半波長板を配置することによって得ることができます。この波長板を回転させることにより、サンプルに送信される光の強度は、独立してポンプビーム（後述する）で送信される強度の調整することができます。 </li><li>波長変換光が出る光は顕微鏡対物レンズの背面開口部を埋めるのに十分な大きさになるように、と指示倒立顕微鏡（IX - 71、オリンパス、中に選択した第二色消し（F = 500 mm）とrecollimatedさtwoステアリングミラーによるセンターバレー、PA）。 </li><li>システムのほとんどのモノリシック構成要素の中に収容された光学素子である顕微鏡の目的は、光軸を定義しています。この軸に励起光を揃えるには、ミラーは、顕微鏡の試料面に配置されます。 CCDカム時代（μEye、IDS、Obersulm、ドイツ）顕微鏡のイメージングポートに接続された上でのバック反射されたレーザ光を観察しながら、2つのステアリングミラーは、その後、繰り返し調整されています。カメラの画像が顕微鏡の視野の中央にあると仮定すると、ビームは、焦点スポットがz -軸に沿って目的の顕微鏡のチップと翻訳を中心とする軸上の中心点を変更していないです。デフォーカスビームの。 </li><li>サンプルを試料面に配置し、照射するとレーザー光ラマン散乱が発生します。顕微鏡対物の下に置かれたダイクロイックフィルターは、顕微鏡のサイドポートにラマン散乱光を指示、励起光から波長シフトしたラマン散乱光を（および蛍光）を分離する。顕微鏡は、信号光は、コリメート顕微鏡から出ていることなど、このパス内の任意のレンズをはずしてするように変更されました。 </li><li>顕微鏡から出てきた信号光は、グラントムソン偏光板の開口よりも大きいため、0.47x望遠鏡は、ビームを縮小するために使用されている2つの無色のダブレット（F1 = 75ミリメートル、F2 = 35 mm）の構築。 </li><li>信号光は、研究室の枠の縦の方向に0 °で配向さグラントムソン偏光子によって偏光であり、そしてそれはポンプビームと再結合されたダイクロイックミラーに指示した。 </li></ol> 3。ピーク効率で動作する光ゲートためには、注意が同様にポンプ光（カービーム）の準備に注意する必要があります。 <ol&gt; <li>ポンプパルスは、最初の信号ビームの最終的なサイズを一致させるには、2つ色消しダブレット（F1 = 35ミリメートル、F2 = 100 mm）で構成された望遠鏡で0.35xによって拡大されます。 </li><li>ポンプビームは、（後述するチューニング）ポンプと信号パルスの時間的重複を確保するために調整することができる直線移動ステージ上に配置直角プリズムから構成されるディレイラインに送信されます。 </li><li>ディレイラインの後、ビームは実験室の枠に垂直に対して45 °に配向半波長板と偏光板を介して送信されます。それは非線形媒質に達したときにこれはポンプビームの適切な偏光状態を保証します。 </li><li>光は、2つのステアリングミラー、細かく信号光と空間的にそれが重なるそのようなポンプのビームの位置を調整するために使用されるピエゾコントロールを持つ1つのオフ反映されます。オーバーラップは、2つの場所、一つの近くと遠くの梁が結合されるダイクロイックミラーから1つのポンプと信号光を観察することによって得られる。遠点でのビームのオーバーラップに近いポイントで2つのビームのオーバーラップする最初のステアリングミラーを使用して、そしてピエゾミラーによって、ポンプビームは、信号光と正確に一直線上にすることができます。 </li><li>結合された2つのビームで、カーゲートと収集システムが収集したタイムゲート信号を最大化するように設定されています。 </li></ol> 4。結合された2つのビームで、カーゲートと収集システムが収集したタイムゲート信号を最大化するように設定されています。 <ol><li>ポンプと信号ビームは、まず非線形媒質内でエキサイティングなラマン散乱からあらゆる残留励起光を防ぐために、404 nmでの6のODを持つダイクロイックフィルターを通過します。 </li><li>ポンプと信号ビームは両方非線形材料を含む1cmの光路長の石英キュベットに色消し（F = 35 mm）と集中しています。適切な高い非線形指数（CS 2よりも高い）、および適切に短い時間応答（&lt;2 PS）を有する任意の非線形材料は、ここで利用することができます。これらの実験のために、我々は非線形屈折率n 2 = 3.1 × 10 -18 m 2の / Wを持っている二硫化炭素、CS 2を 、使用してください光は、最初と同じ焦点距離で2番目のダブレットでrecollimatedている。 </li><li>ビームは、回転マウント上にして、組み合わせは808 nmで10のODを持っていることを吸収し、干渉フィルターのセットを介して通過し、グラントムソンアナライザされています。 </li><li>最後に、信号光は、光ファイバはx、y、zの翻訳を可能にする段階でマウントされている50μmマルチモード光ファイバ、に色消し（F = 35 mm）と焦点を当てています繊維は、接続されたCCDカメラ（それぞれSP2300iとPixis 100B、、プリンストンインスツルメンツ製の両方、トレントン、ニュージャージー州）と商業イメージング分光器に接続されている。 </li><li>収集された信号を最大にする収集システムを揃えるには、アナライザは0に設定され°、トルエンのテストサンプルは、サンプルの平面に配置されます。繊維のマウントのx、y、zのコントロールを調整することにより、収集されたラマン信号が最適化されています。 </li><li>ポンプと信号ビームの適切な空間的および時間的重複を確保するため、ミラーは、顕微鏡の試料面に配置されます。 404 nmのフィルターがシステムから削除されます。アナライザで90 °回転再帰反射404 nmのビームは、それがカメラを飽和させないように調整強度を分光器に送信されます。オフポンプビームと、アナライザは送信される404 nmの信号を最小限に抑えるために回転する。ポンプビームがオンに戻すと404 nmの光の透過が増加し始めるまで、遅延ステージは徐々に調整されています。その後、繰り返し遅延ステージ、ピエゾミラー、および繊維のx、y、zのコントロールを調整することで、一つは信号を最大化します。 </li><li>レトロ反射404 nmの光とラマン散乱光は、システムを介してわずかに異なるパスを取る可能性があるため、最終的な調整を試料ステージに強いラマン散乱体を（トルエンなど）を配置することによって作られ、わずかに調整変更することにより、アライメントラマン信号を最適化するために繊維の段階で、piezeo -電動ミラー、、x、y、z各コン​​トロールを遅らせる。 </li></ol> 5。単一のタイムゲーティッドラマンスペクトルの収集は、複数のスペクトルの買収は、システムのアーチファクトを補正する必要があります。 <ol><li> 0 °に設定アナライザ、励起ビームのオンとオフのポンプビームで、&quot;ungated&quot;スペクトル時間ゲーティングシステムの恩恵なしに取得されるスペクトルを表す、取得されます。 </li><li>アナライザは、90 °、励起光とポンプ光がオフのままに設定すると、バックグラウンドのスペクトルは、システム内の偏光板と他の要素を通じて漏れ迷光の量を表す、取得されます。 </li><li> 90℃で、残りのアナライザと°と上のすべての梁、&quot;ゲート&quot;スペクトルはポンプ光の存在によって交差した偏光子を通過できるラマン散乱光を表す、取られる。 </li><li>最後に、まだ90 °、励起ビームのオフとポンプビーム上でアナライザを使用して、第二のバックグラウンドスペクトルが取られ、分光器に入る808 nmの光の残留量の&quot;ゲート&quot;スペクトルへの寄与を表す。 </li><li>さらに、スペクトルはカメラや電子機器のベースライン&quot;暗い&quot;信号レベルを特徴づける、すべてのレーザーをオフ取られます。 </li><li>スペクトルは、しばしば長い積分時間を必要とするため、それは宇宙線の適切な補正を可能にするいくつかの部分（フレーム）に、この積分時間を破ることが不可欠です - いくつかの分のスパンでデータを取得する共通の問題。 </li></ol> 6。一度取得されると、いくつかの処理ステップは、データの品質と外観を改善するために役立ちます。 <ol><li>最初に、すべてのスペクトルが濃い&quot;濃い&quot;スペクトルをオフに引くことにより補正される。 </li><li>宇宙線を補正するために、1回の収集を構成するいくつかのフレームは、ピクセル単位で相互に比較されます。すべてのフレームでそのピクセルの中央値から2中央値偏差の外にある任意のフレームの任意のピクセルに対して、そのピクセルの値はすべてのフレーム間の中央値で置き換えられます。 </li><li>宇宙線訂正のフレームは、その結果、平均化やSavitzky - Golayフィルタ1によって平滑化されています。 </li><li> &quot;真の&quot;ゲーティッドスペクトラムを抽出するには、我々は、測定ゲートスペクトルから&quot;励起のみ&quot;と&quot;ポンプのみ&quot;のスペクトルを減算する。 </li><li>最後に、ゲートとungatedスペクトルは、リーバーとMahadevan -ジャンセン2の方法を用いて決定した第 5次多項式を、減算することによって補正さの背景です。 </li></ol> 7。代表的な結果： <img src="/files/ftp_upload/2592/2592fig1.jpg" alt="図1"/> 図1。カーゲーティングシステムの模式図。 SHGのパスは青で表示されている間、ポンプ光の経路は、赤色で表示されます。蛍光が時間的に除外されたパスが黄色で表示されている間ラマンと蛍光が重なっているパスは、緑で表示されます。次のように略語：BPF、バンドパスフィルタ、CCD、電荷結合素子、DCM、ダイクロイックミラー、FI、ファラデーアイソレータ、λ/ 2、半波長板、LPF、ロングパスフィルタ、NLM、非線形媒質、P、偏光板、SHG、第二高調波発生結晶。 <img src="/files/ftp_upload/2592/2592fig2.jpg" alt="図2"/> 図2トップ：。浸油に溶解したクマリンの生のスペクトル。赤い曲線は開いたままゲート（最大伝送のためのアナライザのセット）で撮影したスペクトルを示しています。黒い曲線は、最小伝送とポンプビーム応用（ティッドスペクトラム）のために整列アナライザーで撮影したスペクトルを示す。青い曲線は、最小伝送と無ポンプビーム応用（ゲートが閉じて開催された）のために整列アナライザーで撮影したspectumを示しています。緑の曲線は、適用される唯一のポンプビームで撮影したスペクトルを示す。破線マゼンタの線は、下のパネルに示すようにスペクトル領域を示している。全てのスペクトルは11点、3次のSavitzky - Golayフィルタで平滑化されています。底部：蛍光バックグラウンドを差し引いた後の液浸油に溶解したクマリンのスペクトル。赤い曲線は、ゲートを持つスペクトルが開かれており、青色の曲線は、ゲーティッドスペクトラムです。ゲーティッドスペクトラムは、明らかにオイルの複雑な高波数のピーク特性を示しています。

<ol>
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利害の衝突は宣言されません。

生物医学ラマン分光法の分野は、生物学的診断でいくつかの困難な課題を解決するため、その実証可能性の結果として、過去数年間での関心の高まりを見ている。例えば、ラマンスペクトルは、癌の検出3、4、5、6の診断的価値を有することが示されている。ラマン分光法は、細菌の定量7、8、細菌の薬剤応答9にも使用されています。また、骨の健康10からbiofl...

<table border="1"><tbody><tr><th>の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td>レンズ</td><td> ThorLabs </td><td>様々な</td><td>一パーセント、それぞれの最大伝送損失を持つようにコーティングされたすべてのレンズ</td></tr><tr><td>調整可能なチタン：Sapphレーザー</td><td>コヒーレント</td><td>カメレオン</td><td> 30 NJ、200フェムト秒、80 MHzの</td></tr><tr><td> 40X油浸対物レンズ</td><td>オリンポス</td><td> UApo/340 </td><td> NA = 1.35 </td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>オリンポス</td><td> IX - 71 </td><td>側のポートですべてのレンズを削除するように変更</td></tr><tr><td>半波長板</td><td> Thorlabs </td><td> AHWP05M - 600 </td><td></td></tr><tr><td>グラントムソン偏光子</td><td> Thorlabs </td><td> GTH10M </td><td> 〜10％の伝送損失</td></tr><tr><td>スペクトロメータ</td><td> PIアクトン</td><td> SP2300i </td><td></td></tr><tr><td> CCD </td><td> PIアクトン</td><td> Pixis 100B </td><td></td></tr><tr><td>数理ソフトウェア</td><td>サイバネットシステム</td><td> MATLAB </td><td>バージョン2008A </td></tr><tr><td>ファラデーアイソレータ</td><td> EOT </td><td> BB8 - 5I </td><td></td></tr><tr><td>ピエゾ電気の鏡</td><td>ニューポート</td><td> AG - M100 </td><td></td></tr><tr><td> BBO結晶</td><td> CASIX </td><td>カスタムの</td><td>厚さ1mm </td></tr><tr><td>バンドパスフィルタ1 </td><td>アンドーバー</td><td> 008FC14 </td><td> 808 ± 0.4 nmの</td></tr><tr><td>ダイクロイックミラー</td><td> Semrock </td><td> FF662 - FDI01 </td><td> 662 nmのバンド端</td></tr><tr><td>ロングパスフィルター</td><td> Semrock </td><td> BLP01 - 405R </td><td> 417 nmのバンド端</td></tr><tr><td>バンドパスフィルタ2 </td><td> Semrock </td><td> FF02-447/60 </td><td> 417から447 nmの</td></tr><tr><td> CS 2 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 335266 </td><td>純度99％ </td></tr><tr><td>クマリン30 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 546127 </td><td>純度99％ </td></tr><tr><td>液浸油</td><td> Cargille </td><td> 16242 </td><td>タイプDF </td></tr></tbody></table>

rejection of fluorescence background in resonance and spontaneous raman microspectroscopy

ラマン分光法は、多くの場合、特に生体試料のために、強い蛍光背景に悩まされている。サンプルは、超高速パルスのパルス列で励起されている場合は、時間的スケールピコ秒でのスペクトル重複する信号を分離できるシステムは、後着蛍光光源からのラマン散乱光を到着速やかに分離することができます。ここでは、ラマン及び蛍光信号を分離するために低消費電力光カーゲートの形で全光スイッチングを使用する複雑な非線形光学系の構築と運用について説明します。平均電力と80 MHzの繰り返し周波数の2.4 Wを持つ単一の808nmのレーザーは、ラマン散乱を励起するためにサンプルに送られた404 nmの光の&lt;5 mWに変換される808 nmの光の約200 mWのと、分割されます。残りの未変換の808 nmの光は、それはすべての光シャッターのためのポンプとして機能する非線形媒質に送信されます。シャッターが開き、約5％のピーク効率は、800フェムト秒後終了。このシステムを用いて、我々は、正常にパルスエネルギーと生物学的に安全なままに平均電力を使用して80 MHzの繰り返し率でラマンと蛍光信号を分離することができます。システムは、光パワーの面では容量に余裕がないので、細部のいくつかのデザインと配置​​に関する考慮そのシステムのスループットを最大化を支援する。私達はまた私達のカー媒質内信号とポンプ光の空間的および時間的重なりを得るためのプロトコルだけでなく、スペクトル取得のための詳細なプロトコルを議論する。最後に、我々は時間ゲーティングシステムを使用して強い蛍光の存在下で得られたラマンスペクトルのいくつかの代表的な結果を報告する。

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Rejection of Fluorescence Background in Resonance and Spontaneous Raman Microspectroscopy

我々は、蛍光信号からのラマン分離する超高速全光スイッチングを使用する複雑な非線形光学系の構築と運用について説明します。このシステムを用いて、我々は、正常にパルスエネルギーと生物学的に安全なままに平均電力を利用したラマン及び蛍光信号を分離することができます。

共鳴と自発ラマン顕微の蛍光バックグラウンドの除去

Raman spectroscopy is often plagued by a strong fluorescent background, particularly for biological samples. If a sample is excited with a train of ...

rejection-fluorescence-background-resonance-spontaneous-raman

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.0K ビュー.  University of California, Davis. 我々は、蛍光信号からのラマン分離する超高速全光スイッチングを使用する複雑な非線形光学系の構築と運用について説明します。このシステムを用いて、我々は、正常にパルスエネルギーと生物学的に安全なままに平均電力を利用したラマン及び蛍光信号を分離することができます。

ビデオ: Rejection of Fluorescence Background in Resonance and Spontaneous Raman Microspectroscopy

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular events. Viscosity is one of the key parameters affecting the diffusion of molecules and proteins, and changes in viscosity have been linked to disease and malfunction at the cellular level.1-3 While methods to measure the bulk viscosity are well developed, imaging microviscosity remains a challenge. Viscosity maps of microscopic objects, such as single cells, have until recently been hard to obtain. Mapping viscosity with fluorescence techniques is advantageous because, similar to other optical techniques, it is minimally invasive, non-destructive and can be applied to living cells and tissues.
Fluorescent molecular rotors exhibit fluorescence lifetimes and quantum yields which are a function of the viscosity of their microenvironment.4,5 Intramolecular twisting or rotation leads to non-radiative decay from the excited state back to the ground state. A viscous environment slows this rotation or twisting, restricting access to this non-radiative decay pathway. This leads to an increase in the fluorescence quantum yield and the fluorescence lifetime. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) of modified hydrophobic BODIPY dyes that act as fluorescent molecular rotors show that the fluorescence lifetime of these probes is a function of the microviscosity of their environment.6-8 A logarithmic plot of the fluorescence lifetime versus the solvent viscosity yields a straight line that obeys the F&ouml;rster Hoffman equation.9 This plot also serves as a calibration graph to convert fluorescence lifetime into viscosity.
Following incubation of living cells with the modified BODIPY fluorescent molecular rotor, a punctate dye distribution is observed in the fluorescence images. The viscosity value obtained in the puncta in live cells is around 100 times higher than that of water and of cellular cytoplasm.6,7 Time-resolved fluorescence anisotropy measurements yield rotational correlation times in agreement with these large microviscosity values. Mapping the fluorescence lifetime is independent of the fluorescence intensity, and thus allows the separation of probe concentration and viscosity effects. 
In summary, we have developed a practical and versatile approach to map the microviscosity in cells based on FLIM of fluorescent molecular rotors.

Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) has emerged as a key technique to image the environment and interaction of specific proteins and dyes in living cells. FLIM of fluorescent molecular rotors allows mapping of viscosity in living cells.

生細胞における分子ローターの蛍光寿命イメージング

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

生物工学

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

ラマン分光法を用いた細胞と細胞外マトリックスの非接触、ラベルフリーの監視

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

全内部反射蛍光顕微鏡を用いた微生物のCortex組織とダイナミクスの可視化、

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

細胞内小胞の追跡への応用：変形二光子顕微鏡での3d軌道の追跡

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range of 10-100 &#197;. By measuring the distances under various ligated conditions, conformational changes of the protein can be easily assessed. With LRET, a lanthanide, most often chelated terbium, is used as the donor fluorophore, affording advantages such as a longer donor-only emission lifetime, the flexibility to use multiple acceptor fluorophores, and the opportunity to detect sensitized acceptor emission as an easy way to measure energy transfer without the risk of also detecting donor-only signal. Here, we describe a method to use LRET on membrane proteins expressed and assayed on the surface of intact mammalian cells. We introduce a protease cleavage site between the LRET fluorophore pair. After obtaining the original LRET signal, cleavage at that site removes the specific LRET signal from the protein of interest allowing us to quantitatively subtract the background signal that remains after cleavage. This method allows for more physiologically relevant measurements to be made without the need for purification of protein.

We describe here an improved Luminescence Resonance Energy Transfer (LRET) method where we introduce a protease cleavage site between the donor and acceptor fluorophore sites. This modification allows us to obtain specific LRET signals arising from membrane proteins of interest, allowing for the study of membrane proteins without protein purification.

発光共鳴エネルギーは、哺乳動物細胞で発現膜タンパク質の立体構造変化を研究するために転送

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

商業顕微鏡でのライブ細胞膜上の分子拡散法への高速蛍光イメージングから

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths from the myocardium. Genetic program defects in the Notch signaling cascade are involved in ventricular defects such as Left Ventricular Non-Compaction Cardiomyopathy or Hypoplastic Left Heart Syndrome. Using this protocol, it can be determined that shear stress driven trabeculation and Notch signaling are related to one another. Using Light-sheet Fluorescence Microscopy, visualization of the developing zebrafish heart was possible. In this manuscript, it was assessed whether hemodynamic forces modulate the initiation of trabeculation via Notch signaling and thus, influence contractile function occurs. For qualitative and quantitative shear stress analysis, 4-D (3-D+time) images were acquired during zebrafish cardiac morphogenesis, and integrated light-sheet fluorescence microscopy with 4-D synchronization captured the ventricular motion. Blood viscosity was reduced via gata1a-morpholino oligonucleotides (MO) micro-injection to decrease shear stress, thereby, down-regulating Notch signaling and attenuating trabeculation. Co-injection of Nrg1 mRNA with gata1a MO rescued Notch-related genes to restore trabeculation. To confirm shear stress driven Notch signaling influences trabeculation, cardiomyocyte contraction was further arrested via tnnt2a-MO to reduce hemodynamic forces, thereby, down-regulating Notch target genes to develop a non-trabeculated myocardium. Finally, corroboration of the expression patterns of shear stress-responsive Notch genes was conducted by subjecting endothelial cells to pulsatile flow. Thus, the 4-D light-sheet microscopy uncovered hemodynamic forces underlying Notch signaling and trabeculation with clinical relevance to non-compaction cardiomyopathy.

Here, we present a protocol to visualize developing hearts in zebrafish in 4-Dimensions (4-D). 4-D imaging, via light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), takes 3-Dimensional (3-D) images over time, to reconstruct developing hearts. We show qualitatively and quantitatively that shear stress activates endocardial Notch signaling during chamber development, which promotes cardiac trabeculation.

光シート蛍光顕微鏡のゼブラフィッシュ心臓の開発上のせん断応力を変調効果の 4次元画像をキャプチャするには

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Spontaneous Formation and Rearrangement of Artificial Lipid Nanotube Networks as a Bottom-Up Model for Endoplasmic Reticulum

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense lipidic nanotubes that are, in terms of morphology and dynamics, reminiscent of ER. The networks are derived from phospholipid double bilayer membrane patches adhering to a transparent Al2O3 substrate. The adhesion is mediated by Ca2+ in the ambient buffer. Subsequent depletion of Ca2+ by means of BAPTA/EDTA causes retraction of the membrane, resulting in spontaneous lipid nanotube network formation. The method only comprises phospholipids and microfabricated surfaces for simple formation of an ER model and does not require the addition of proteins or chemical energy (e.g., GTP or ATP). In contrast to the 3D morphology of the cellular endoplasmic reticulum, the model is two-dimensional (albeit the nanotube dimensions, geometry, structure, and dynamics are maintained). This unique in vitro ER model consists of only a few components, is easy to construct, and can be observed under a light microscope. The resulting structure can be further decorated for additional functionality, such as the addition of ER-associated proteins or particles to study transport phenomena among the tubes. The artificial networks described here are suitable structural models for the cellular ER, whose unique characteristic morphology has been shown to be related to its biological function, whereas details regarding formation of the tubular domain and rearrangements within are still not completely understood. We note that this method uses Al2O3 thin-film-coated microscopy coverslips, which are commercially available but require special orders. Therefore, it is advisable to have access to a microfabrication facility for preparation.

Solid-supported, protein-free, double phospholipid bilayer membranes (DLBM) can be transformed into complex and dynamic lipid nanotube networks and can serve as 2D bottom-up models of the endoplasmic reticulum.

自発的な形成と小胞体のボトムアップ モデル人工脂質ナノチューブ ネットワークの転位

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense ...

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic molecular vibration, thus providing a perfect tool for in vivo study of biological processes at subcellular resolution. By integrating two-photon excited fluorescence (TPEF) imaging into the SRS microscope, the dual-modal in vivo imaging of tissues can acquire critical biochemical and biophysical information from multiple perspectives which helps understand the dynamic processes involved in cellular metabolism, immune response and tissue remodeling, etc. In this video protocol, the setup of a TPEF-SRS microscope system as well as the in vivo imaging method of the animal spinal cord is introduced. The spinal cord, as part of the central nervous system, plays a critical role in the communication between the brain and peripheral nervous system. Myelin sheath, abundant in phospholipids, surrounds and insulates the axon to permit saltatory conduction of action potentials. In vivo imaging of myelin sheaths in the spinal cord is important to study the progression of neurodegenerative diseases and spinal cord injury. The protocol also describes animal preparation and in vivo TPEF-SRS imaging methods to acquire high-resolution biological images.

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows label-free imaging of biomolecules based on their intrinsic vibration of specific chemical bonds. In this protocol, the instrumental setup of an integrated SRS and two-photon fluorescence microscope is described to visualize cellular structures in the spinal cord of live mice.

インビボ で2光子蛍光と誘導ラマン散乱顕微鏡を組み合わせた生体組織のイメージング

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has been shown to be able to provide hematoxylin and eosin (H&amp;E)-equivalent images that allow fast and reliable diagnosis of brain cancer. Such capability has enabled exciting intraoperative cancer diagnosis applications. Two-color SRS imaging of tissue can be done with either a picosecond or femtosecond laser source. Femtosecond lasers have the advantage of enabling flexible imaging modes, including fast hyperspectral imaging and real-time, two-color SRS imaging. A spectral-focusing approach with chirped laser pulses is typically used with femtosecond lasers to achieve high spectral resolution. 
Two-color SRS acquisition can be realized with orthogonal modulation and lock-in detection. The complexity of pulse chirping, modulation, and characterization is a bottleneck for the widespread adoption of this method. This article provides a detailed protocol to demonstrate the implementation and optimization of spectral-focusing SRS and real-time, two-color imaging of mouse brain tissue in the epi-mode. This protocol can be used for a broad range of SRS imaging applications that leverage the high speed and spectroscopic imaging capability of SRS.

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a powerful, nondestructive, and label-free imaging technique. One emerging application is stimulated Raman histology, where two-color SRS imaging at the protein and lipid Raman transitions are used to generate pseudo-hematoxylin and eosin images. Here, we demonstrate a protocol for real-time, two-color SRS imaging for tissue diagnosis.

組織診断のためのマウス脳のリアルタイム、2色刺激ラマン散乱イメージング

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has ...