このプロトコルは、スペクトル集束SRS顕微鏡の実装と最適化、およびリアルタイム刺激ラマン組織学アプリケーションにどのように使用できるかを実証します。この技術の主な利点は、SRSが組織処理と染色を必要としないため、機器が適切に整列されるとサンプルを処理できる速度です。このプロトコルは、組織学だけでなく、他のSRSアプリケーションにも適用可能です。
このような用途には、小分子、薬物、細胞、および組織が含まれる。まず、ポンプビーム用の無彩色レンズを1対設置し、レーザービームサイズを起点として2倍に拡大します。100 mm と 200 mm のレンズを互いに約 300 mm 離して配置します。
次に、ポンプビームを両方のレンズの中心に合わせます。次に、2番目のレンズの後に鏡を置き、ビームを1メートル以上離れた壁に送ります。IRカードで鏡から壁までのビームをトレースし、ビームのサイズが変化するかどうかを確認します。
ビームのサイズが距離の関数として変化する場合は、ビームをコリメートします。調整のためにいくつかのステアリングミラーとダイクロイックミラーを取り付けることによって、2つのレーザービームを結合する。ポンプとストークスの空間的オーバーラップを最適化するには、ダイクロイックミラーの後のビームを約1メートル離れた2つの異なる位置で監視します。
ステアリングミラーとそれに続くダイクロイックミラーを繰り返し調整して、ストークスビームをポンプビームに合わせます。スキャンミラーが駐車位置にあるときにステアリングミラーのペアを調整して、結合ビームがレーザー走査顕微鏡のスキャンミラーの中央に送られることを確認します。集光器の後、焦点距離がそれぞれ100ミリメートルと30ミリメートルの別のレンズペアを使用して、透過ビームをフォトダイオードに中継し、両方のビームがフォトダイオード内に含まれていることを確認します。
次に、変調されたストークスビームを遮断するために2つのローパスフィルタを取り付けます。ストークスビーム経路にビームサンプラーを配置してビームの10%をピックアップし、高速フォトダイオードに送信して80メガヘルツのパルス列を検出します。ファンアウトバッファの出力の1つを取り、バンドパスフィルタでフィルタリングして、20メガヘルツの正弦波を得ます。
次に、RFアッテネータを使用して、出力ピークからピーク電圧までを約500ミリボルトに調整します。得られた出力を移相器に送信すると、電圧源でRF位相を微調整できます。この出力をRFパワーアンプに送信し、アンプの出力をEOMに接続します。
ストークスビームのブロックを解除した後、ビーム経路にフォトダイオードを配置して、最初のEOMの変調深さを最適化します。EOM電圧と1/4波長板を調整して、変調深度が満足のいくものになるまで調整します。ダイクロイックミラーの後にフォトダイオードを配置し、レーザー光を検出します。
最初にストークスビームをブロックしてから、オシロスコープのポンプパルスピークの1つにズームインします。垂直カーソルを置いて、このピークの時間的位置をオシロスコープでマークします。次に、ポンプビームをブロックし、ストークスビームのブロックを解除します。
遅延段を平行移動して、オシロスコープのピーク位置を前のステップのマーク位置に一時的に一致させます。2つのビームを一致させるのに必要な遅延距離を計算し、その後、速いビームのビーム経路を延長するか、遅いビームのビーム経路を短くする。次にスペーサーとしてDMSOと両面テープを用いて顕微鏡スライドサンプルを用意し、スライドとカバースリップの間にサンプルを保持する。
カバースリップ側を顕微鏡対物レンズに向けて顕微鏡上に試料を置き、明視野照明下でI片から試料を観察した。ガラステープ界面の気泡の最上層と最下層の両方でサンプルの焦点を見つけ、テープの2つの層の間にあるように焦点を移動します。次に、同調可能なビーム出力を798ナノメートルに設定します。
コンデンサーの光スループットに基づいて、対物レンズの焦点でポンプとストークスビームに対してそれぞれ約40ミリワットになるように光パワーを調整します。次に、MATLABでスキャン画像を開き、フォーカスというラベルの付いたボタンをクリックしてスキャンを開始します。ガルボスキャナの前にステアリングミラーを調整して、DC信号をチャンネル1ディスプレイの中央に配置します。
電動遅延段を動かし、チャンネル2ディスプレイに表示されるロックイン出力を注意深く観察します。最後に、AC信号強度を最大化するために時間遅延を調整します。ダイクロイックミラーを調整して、SRS信号をACチャンネルの中央に配置します。
次に、ロックインアンプの位相を調整して信号を最大化します。サンプルスライドを顕微鏡に取り付けた後、前述のように、サンプルフォーカスで両方のビームのパワーをそれぞれ約40ミリワットに調整しました。MATLABからスキャン画像を開きます。
次に、DMSOの2,913逆センチメートルのラマンピークに対応する遅延段を走査することによって、最大のSRS信号を求める。DMSOの2,913逆センチメートルのラマンピークに対応するSRS画像を取得する。ImageJ で画像を開き、フレームの中央にある小さな領域を選択します。
メジャー関数を使用して、選択した領域の値の平均と標準偏差を計算します。周波数アクセスキャリブレーションでは、DMSOの2、913、2、994逆センチメートルのラマンピークをカバーする遅延段範囲でハイパースペクトルスキャンを保存します。次に、ハイパースペクトルデータセットに対応するステージ位置を保存します。
ステージ位置に対して線形回帰を実行し、ラマンシフトを2、913、2、994逆センチメートルで行います。線形回帰式を使用して、遅延位置を対応するラマン周波数に変換します。スペクトル分解能の較正のために、ロッドの挿入による光路長の増加を伴う前の位置に基づいてステージ位置を推定する。
ガラス棒を追加するとビームがわずかにずれるため、ビームの空間的なオーバーラップを再調整します。偏光ビームスプリッター、1/4波長板、および第2のEOMを第1のEOMの後の浸潤ビーム経路に設置する。2番目のEOMに入力された信号を抜き、次に最初のEOMに入力された信号を差し込み、電源を入れます。
ストークスビームを20メガヘルツに変調するには、ビームを最初のEOMに送ります。最初のEOMの傾きと位置を調整して、ビームがEOMクリスタルの中央に配置されるようにします。両面テープ、顕微鏡スライド、カバーガラスで組織スライドサンプルを作製する。
カバースリップ側が顕微鏡対物レンズに面して顕微鏡上に試料を置きます。エピモードSRSイメージングでは、ビームが顕微鏡に入る前に1/2波長板を設置して、顕微鏡に入るビームの偏光を変化させます。偏光ビームスプリッタを対物レンズの上に配置して、偏光解除された逆反射ビームが検出器に到達できるようにします。
次に、75ミリメートルのアクロメートレンズと30ミリメートルの非球面レンズを使用して、対物の背面開口部から光検出器に後方散乱光子を中継する。検出器を取り付けて、偏光ビームスプリッタによって導かれた後方散乱光を収集します。次に、変調ビームが検出器に入るのを阻止するフィルターを取り付けます。
ロッドの長さを変えると、スペクトル分解能に影響します。ガラスチャーピングロッドを使用しない場合、DMSOからの2つのラマンピークはまったく解決されません。ガラスのチャーピングロッドの数の増加は、満足のいく点で2つのピークを解決し始める。
マッチングチャーピングは両方のピークを解決し、ステージ位置を周波数に合わせて較正するために使用できます。DMSOスペクトルを画像化するために使用される直交偏光の2つの時間遅延パルス列は、許容可能な変調深さと時間的分離を有するSRS励起との間の時間遅延を示す。対照的に、位相シフトの悪い2色のSRSは、反転または負のピークを生じる。
2,850および2,930逆センチメートルのエクスビボマウス脳組織におけるリアルタイム2色SRS画像化がここに示されている。生の脂質およびタンパク質画像を色分けして、脂質およびタンパク質の寄与を示す単一の画像を生成した。偽ヘマトキシリンおよびエオジン再着色は、病理学的適用のためのヘマトキシリンおよびエオジン染色を模倣するためにも行われた。
空間的時間オーバーラップと空間分解能の最適化は、SRS の空間フォーカス アプローチにとって最も重要なステップです。この方法は、一般に、過渡吸収顕微鏡などの他のポンププローブ顕微鏡実験に適用可能である。この方法はまた、細胞および組織における非蛍光分子の画像化を可能にする。
ここで提示された方法は、クリニックにおける刺激ラマン組織学の将来の翻訳のための画像取得時間を短縮する。
