インビトロ転写RNAベースのルシファーゼアッセイのプロトコルは、ポックスウイルス感染細胞の翻訳調節を研究するのに役立ちます。さらに、ポリ(A)リットルのカスタマイズされた長さは、翻訳に対するその規制の影響を研究することができます。この技術の主な利点は、mRNAおよび翻訳開始の広いスペクトルにおける5'UTRおよび3'UTRのようなCis要素による翻訳調節の研究を可能にすることです。
インビトロ転写されたRNAベースのルシファーゼレポーターアッセイは、キャップおよびその他の修飾に修飾を組み込み、翻訳に対する効果をテストするために使用するように調整され得る。まず、前方および逆プライマーを設計して、5〜3'方向に次の要素を含むPCRアンプリコンを生成する:T7-プロモーター、ポリ(A)リットル、T7_12A-Flucと呼ばれるポリ(A)尾部のホタルルシファーゼORFは、前方プライマーにいくつかの余分なヌクレオチドを含み、その後にT7プロモーターポリ(A)リットルまたは所望ましい5'UTR配列および約20ヌクレオチドを含むレポーター遺伝子のORFの5'末端に対応する溶融温度に基づいてプライマー長を調整し、プライマー内の対応する領域が遺伝子のセンス鎖と同一であることを確認します。
次に、ポリ(A)尾と約20ヌクレオチドを含むようにリバースプライマーを設計します。レポーター遺伝子のORFの3'末端に対応する溶融温度に基づいて調整し、プライマーの対応する領域が遺伝子のアンチセンス鎖と同じであり、フレーム内停止コドンがPoly(A)尾の前に存在することを確認します。内部制御の場合は、5'~3'方向に次の要素を含むプライマーの別のセットを設計します:T7-プロモーター、コザック配列、レニラルシファーゼORF、およびポリ(A)テールを含むランダムな5'UTRコードシーケンスは、T7_Kozak-ルクと呼ばれます。
反応をセットアップするには、PCRチューブに次の順序で試薬を加えます:DNaseフリーウォーター、2X高忠実度DNAポリメラーゼ、プライマーおよび配列確認されたルシファーゼテンプレートDNA。標準的な3段階PCRサイクルでDNAテンプレートを生成した後、分子量標準と共に1%アガロースTAEゲル電気泳動でPCR反応の5〜10%を実行してPCR産物を検出します。PCR産物のサイズを決定するには、UVイルミエータの下でゲルを視覚化します。
PCR産物の正しいサイズを決定した後、100マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を使用して市販のPCR精製キットを使用して、DNAを溶出させます。分光光度計を用いて精製したDNAの濃度を確認し、すぐにインビトロ転写に使用するためにマイナス20°Cで保存します。PCR産物からRNAを合成するには、マイクロ遠心分離管に次の試薬を加えます:DNase-RNaseフリーウォーター、NTPバッファーミックス、キャップアナログ、PCR製品テンプレート、およびIn vitroトランスクリプションキットからT7-RNAポリメラーゼミックス。
よく混ぜます。37°Cで2時間インキュベートし、RNA精製キットを使用して合成されたRNAの精製に進みます。精製されたRNAを確認するには、RNAを70度で5分間加熱し、二次構造を除去し、1.5アガロースTBEゲルで実行します。
次に、UVイルミエーターの下でゲルを視覚化します。分光光度計を用いて精製したRNAの濃度を確認します。アリコートはそれをし、マイナス80度で保存します。
24ウェルプレートにHeLa細胞を播種して翌日80~90%の合流を達成し、5%の二酸化炭素で摂氏37度のインキュベーターで一晩インキュベートします。5の感染の多重度でヒラ細胞をワクシニアウイルスに感染させ、比較のために感染していないHeLa細胞を保つ。その後、10〜12時間5%の二酸化炭素で37度のプレートをインキュベートします。
感染後の所望時間の後、ホタルルシファーゼmRNAを含む12A配列の480ナノグラムと1つのマイクロ遠心チューブにレニラルシファーゼmRNAを持つコザック配列の20ナノグラムを混合する。別のマイクロ遠心分離チューブに、カチオン性脂質トランスフェクション試薬1.1マイクロリットルを加える。両方のチューブに55マイクロリットルの減らされた血清培地を加え、室温で5分間混合してインキュベートします。
次に、減らされた血清培地を含む55マイクロリットルのカチオン性脂質トランスフェクション試薬を、チューブをmRNAに加える。ピペットと軽く、しかし十分に混ぜ、室温で15分間インキュベートします。インキュベーション中に、細胞から細胞培養培地を取り出し、1ウェルあたり400マイクロリットルの減らされた血清培地を加える。
インキュベーションが完了したら、24ウェルプレートのウェルごとに100マイクロリットルの混合物を加えます。12A FlucとKozak Rluc mRNAとの共トランスフェクション後5時間、細胞から還元された血清培地を除去し、ルシファーゼアッセイキットから150マイクロリットル1Xの溶菌バッファーを2つのレポーターアッセイを行うことができる。室温で10分間インキュベートした後、ゴムと滅菌シリンジを使用して細胞を掻き取り、マイクロ遠心チューブに移します。
ペレット細胞の破片に、摂氏4度で10分間12,000回gのリセートを遠心分離する。不透明な壁の96ウェルのウェルあたり30マイクロリットルの上澄み物を固体底とよく白いアッセイプレートに移す。ルシファーゼアッセイキットとマルチモードプレートリーダールミノ計を使用して、原稿に記載されているように、キネティクス機能を使用して二重発光を測定します。
発光読み取りデータを望ましいファイル形式にエクスポートした後、Fluc値を内部コントロールRluc値で割ることにより、感染していないHeLA細胞およびVACV感染HeLA細胞の12A Fluc mRNAからの相対翻訳速度を決定する。このアッセイは、感染していない細胞およびVACV感染細胞に5'Poly(A)リットルを含むFluc mRNAの翻訳効率をテストするために使用された。感染していない細胞とVACV感染細胞の両方がFlucおよびRluc mRNAとの共感染に成功した。
FlucをRlucで分割すると、細胞内のRNA安定性におけるトランスフェクション効率が正常化した。mRNAを含む5'ポリ(A)リットルは、未感染細胞と比較して、VACV感染時に翻訳上の利点を有する。これは、MRNAトランスフェクションの5時間後に未感染細胞とVACV感染細胞においてRNAレベルが類似していたため、差動トランスフェクション効率またはmRNA安定性によるものではなかった。
プライマーを設計する際には、PCR反応効率だけでなく、増幅DNAを必要とするすべての下流プロセスにも影響を与える可能性がありますので、特別な注意を払ってください。この方法は、Cis要素による翻訳調節を迅速にテストするための重要なアッセイです。可能であれば、この方法は他の相補的な実験によって裏付けられるべきです。
ワクシニアウイルスを使用している間は予防措置を講じ、臭化エチジウムやフェノールなどの化学物質への暴露を避けるべきです。
