このプロトコルは、配列レンチウイルスまたはレトロウイルスアッセイライブラリをスクリーニングして、癌細胞における転写因子の新しい調節因子を同定するために使用することができる。この技術の主な利点は、高速、中規模のスループット、および安価であり、ほとんどの研究者が一般的にアクセスできる機器や試薬を使用することです。ライブラリ内の各レンチウイルスベクターを拡大して精製するには、まず96ウェル深井戸プレートの各ウェルにアンピシリン1ミリリットル当たり100マイクログラムを添加したルリアスープ1.3ミリリットルを加えます。
37°Cで一晩インキュベーションし、毎分225回転のためにグリセロールストックの2マイクロリットルで各井戸を接種します。翌日、各細菌培養物を個々の1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移し、遠心分離を行う。メーカーの指示に従って適切な細菌のminiprepキットで各ベクターを精製します。
準備されたライブラリ内の各ベクターについて、24ウェルプレートの井戸を10〜5番目の293FT細胞で種付けし、摂氏37度で、24時間の二酸化炭素を5%でインキュベートします。ライブラリー内の各ベクターに対して設定されるトランスフェクション混合物を調製するために、まずレンチウイルスベクターをヌクレアーゼを含まない水でマイクロリットル当たり50ナノグラムの最終濃度に溶出する。各希釈液の5マイクロリットルを96ウェルPCRプレートの個々のウェルに移します。
トランスフェクション・リザーク1の1.25マイクロリットルxを、23.75マイクロリットルx倍前に加温したトランスフェクションバッファーと混合してトランスフェクションスーパーミックスを作ります。トランスフェクションスーパーミックスを室温で5分間インキュベートします。その後、穏やかなピペットでスーパーミックスにpsPAX2の125ナノグラム倍xとVSVGの125ナノグラム倍xを追加します。
すぐにPCRストリップの各チューブにスーパーミックスをアリコートし、希釈されたウイルスベクターの各ウェルに混合物の25マイクロリットルを転送するためにマルチチャネルピペットを使用しています。室温で20分間のインキュベーションの後、マルチチャネルピペットを使用して、各ウェルから各トランスフェクション混合物の30マイクロリットルを、以前に調製した24ウェルプレート内の293FT細胞の対応するウェルに移します。細胞培養インキュベーター内のさらに24時間インキュベーションのために、各ウェルの培地を500マイクロリットルの新鮮な完全な成長培地に置き換える前に、24時間培養します。
翌日、マルチチャンネルピペットを使用して、各上澄みのウイルス上清とアリコート220マイクロリットルの各上澄み物を新しい96ウェルプレートの2つのウェルに集め、アレイ化されたウイルス上清プレートを生成します。A375細胞を感染に備えるために、24ウェルプレートに10回10~5番目の細胞を、ライブラリー内のウイルスベクターごとに完全増殖培地1個あたり0.5ミリリットルで播種する。薬物選択のコントロールとして機能するように感染しない余分な井戸を含める.
細胞培養インキュベーターで24時間培養した後、調製した細胞培養プレートの各ウェルからの成長培地をポリブレンの1ミリリットル当たり20マイクログラムで補う200マイクロリットルの成長培地に置き換える前に、凍結アレイレンチウイルス上清を室温に設定して解凍する。マルチチャンネルピペットを使用して、各96ウェルから24ウェルプレートの各ウェルにウイルス上清の200マイクロリットルを転送します。細胞を24〜48時間培養インキュベーターに戻す。
インキュベーションの終了時に、各ウェルの培地を、ピューロマイシンを添加した500マイクロリットルの増殖培地に交換し、細胞を細胞培養インキュベーターにさらに48時間戻します。48時間のピューロマイシン選択に続いて、単一のグループのすべてのウェルが同様の細胞密度を有するように細胞を3つまたは4つのグループに分類し、37°Cで5分間の各グループから1つの代表井戸に200マイクロリットルのトリプシン-EDTAを加える。細胞が剥離したら、ピューロマイシンを添加した400マイクロリットルの成長培地でトリプシンを中和し、トリプシン化した各トリプシンから細胞の数を数える。
各細胞懸濁液を、ピューロマイシンと種子500マイクロリットルの細胞を各ウェルから新しい24ウェルプレートの同じウェル位置に補充して、1ミリリットル当たり5番目の細胞に2倍に希釈します。各代表ウェルからのカウントを使用して各グループに残っている各ウェルの細胞数を推定した後、各ウェルにトリプシン-EDTAの適切な量を加え、ミリリットル濃度当たり6番目の細胞に10倍を達成する。トリプシンの間に、新しい24ウェルプレートの適切な対応する井戸にピューロマイシンを添加した成長培地の400マイクロリットルを加えるためにマルチチャネルピペットを使用する。
細胞が剥離したら、各ウェルの内容物を穏やかに混合し、各細胞懸濁液の100マイクロリットルを新しい24ウェルプレートの適切な対応ウェルに移します。その後、細胞を細胞培養インキュベーターに24時間戻す。デュアルルシファーゼレポーターコンストラクトで細胞をトランスフェクトするには、表に示すようにトランスフェクション希釈混合物を調製します。
レポーター希釈混合物を調製するには、トランスフェクションの合計数といくつかの余分なボリュームを掛けた各試薬の量を混合します。次に、トランスフェクション希釈混合物をレポーター希釈混合物と混合し、得られた溶液を室温で15分間インキュベートし、トランスフェクション混合物を製造する。インキュベーション中に、250マイクロリットルのPBSで細胞培養プレートの各ウェルをすすい、各ウェルに447マイクロリットルの新鮮な完全な成長培地を加えます。
次いで、マルチチャネルピペットを使用して、53マイクロリットルのトランスフェクションミックスを細胞培養プレートの各ウェルに分配する。プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%を24時間置きます。ルシファーゼ活性を測定するために、ルシファーゼ活性キットから5X受動溶解バッファーを脱イオン水で1~5回希釈し、キットから必要な量の試薬Aおよび試薬Bバッファーを解凍します。
試薬の準備ができたら、各ウェルの上澄み液を受動リシスバッファーの75マイクロリットルに交換し、時折揺れで室温で30分間プレートをインキュベートします。インキュベーション中に、キットから50X試薬B基板を解凍した試薬Bバッファーで1~50濃度に希釈します。インキュベーションの最後に、4つのブランクコントロールウェルに30マイクロリットルの受動的なライシスバッファーを加え、各ウェルから30マイクロリットルのライセートを96ウェルフラットボトムホワイトアッセイプレートの重複ウェルに移します。
すべてのライセートがメッキされたら、マルチチャンネルピペットを使用して各ウェルに50マイクロリットルの試薬Aを加え、プレートリーダーでホタルルシファーゼ信号を読み取ります。その後、マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルに50マイクロリットルの試薬Bを加え、プレートリーダーでレニラルシファーゼ信号を読み取ります。予想通り、YAP2SAは、コントロールベクターと比較して、ホタルルシファーゼ活性を増加させるが、レニラルシファーゼ活性を増加させる。
これに対し、YAP2SA S94Aはホタルルシファーゼ活性を増加しません。重要なことに、YAP2SAはMCAT TEAD結合要素を欠く最小限のプロモーター構築物の活性を変化させるものではない。YAP-TAZ-TEADレポーターコンストラクトにトランスフェクトされた細胞では、タンデムYAPおよびTAZショートヘアピンはホタルルシファーゼラーゼレベルを有意に低下させたが、コントロールショートヘアピン非ターゲティングコントロールはそうではない。
対照的に、最小レポーターコンストラクトにトランスフェクトされた細胞において、YAP-TAZショートヘアピンRNAはホタルルシファーゼのレベルを有意に変化させるわけではない。各ウェルのレニラシグナルは、短いヘアピン非ターゲティングコントロールまたはYAP-TAZショートヘアピンRNAによっても有意に変化しない。予想通り、YAPおよびTAZ、SARCまたはPI3キナーゼを標的とする短いヘアピンRNAは、YAP-TAZ-TEAD活性を有意に低下させる。
ATM、CDH1、CSK、ERBB2、およびゲルソリンを標的とする短いヘアピンRNAは、それぞれ正規化ホタルルシメラーゼレベルを増加させ、これらのタンパク質がYAPおよび/またはTAZであることを示す公表された研究と一致した。ATR、CCNE2、ERBB4の役割は他の細胞タイプでも確立されているにもかかわらず、これらの遺伝子を標的とする短いヘアピンRNAは、A375細胞における正規化ホタルルシフラーゼレベルを有意に変化させない。この画面に続いて、レギュレータの識別は、転写因子活性のための他の読み出しを使用して検証する必要があります。
アッセイによって同定されたレギュレータの有効なノックダウンも確認されるべきである。感染性レンチウイルスを扱う際には注意して安全ガイドラインに従うことを忘れないでください, ウイルスが人間の感染性である場合は特に.
