成虫ゼブラフィッシュの心臓研究では、薬物治療は通常全身的な方法で行われます。胸腔内注射により、心筋損傷を引き起こすことなく、局所的に心臓に溶液を提供することができます。この方法は、成人ゼブラフィッシュの心臓部の周りに正確に溶液中の薬物、タンパク質、または他の分子の少量の配信を可能にする。
この手順を開始するには、ニードルプーラーを使用して、マイクロインジェクション適合ホウケイ酸ガラス毛細血管を引っ張ります。引っ張られた毛細血管を、粘土または粘着テープをモデリングするレール付きの9センチメートルのペトリ皿に保管してください。一般的なはさみを使用して、スポンジの一部をカットし、その真ん中に魚のようなシルエットを彫ります。
次に、試験したタンパク質または他の化合物を用いて注射液の小さなアリコートを調製する。1xハンクスバランス塩溶液で10%フェノールレッドで補う物質を希釈することにより、アッセイに応じて濃度を調整します。麻酔薬の働く濃度を得るために、魚の水の100ミリリットルを含むビーカーにトリケーヌストック溶液の2〜3ミリリットルを追加します。
まず、上から光を当てるステレオ顕微鏡をオンにし、倍率を16倍に調整します。スポンジに魚の水を浸し、顕微鏡の上に9センチメートルのペトリ皿の上に置きます。焦点を調整し、ステレオ顕微鏡の下で、テキストプロトコルの図1Aに詳述されているように、基本から約7ミリメートルのマイクロキャピラリーの端部を切断するために、虹切除ハサミを使用します。
マイクロインジェクター装置の針ホルダーにカットしたマイクロキャピラリーを挿入します。マイクロローダーのヒントを使用して、適切な流れを得るために注入の圧力を設定するために制御溶液をロードし、針を空にします。この後、選択した注入液の容積を毛細管の先端に積み込み、気泡がないことを確認します。
網を使って成魚を捕まえ、麻酔液に移します。1〜2分後、魚が泳ぎに行き止まり、オペルキュラムの動きが減少したら、プラスチック製のスプーンで魚に触れて接触に反応しないようにします。次に、素早く慎重に魚を、腹側を上にして、濡れたスポンジの溝に移します。
魚の頭は、オペレータの支配的な手から離れて指す必要があります。立体顕微鏡の下で、魚の皮膚の下で鼓動する心臓の動きを注意深く観察する。心拍の上および三角形の真ん中の注入点を視覚的に決定する。
毛管の先端を、本体の軸に対して 30 ~ 45 度の角度で挿入します。マイクロキャピラリーの先端で皮膚を心膜にそっと浸透させます。針が心膜の中に入ったら、マイクロインジェクター装置のペダルを押して注入を完了します。
注射後、胸郭から毛細管をそっと引き出し、すぐに回収のためにシステム水でタンクに魚を移します。麻酔からの完全な回復まで魚を監視します。注射の効果を分析するには、希望の時点で心臓を収集し、さらなる分析のためにそれを準備します。
この研究では、外因性化合物およびタンパク質は、成体ゼブラフィッシュの心臓への影響を研究するために心膜腔に送達される。この方法を検証するために、安楽死させた魚に色と蛍光色素を注入することによって2つの試験実験が行われる。両方のアッセイにおいて、全マウント分析は、心室、心房、および球根動脈を含む心臓全体の標識を明らかにする。
これらの結果は、心臓表面に注入溶液の効率的な広がりの明らかに.心臓研究のための胸腔内注射と腹腔内注射の適合性を比較するために、同様の量のDAPIを両方の方法を用いて注入する。その後、心臓は5分後または120分後に固定されます。
いずれの時点でも腹腔内注射後の心臓ではDAPI陽性細胞は認められない。対照的に、胸腔内注射は心筋におけるDAPI標識核の存在をもたらす。これらの結果は、胸腔内注射が腹腔内注射と比較して、心臓への化合物の送達を改善することを示す。
心臓再生研究のためにこの方法の適合性をテストするために、心室は凍結傷害を受け、その後、凍結傷害後3日と7日で注射を行う。心筋と負傷した組織の両方が多数のDAPI陽性細胞を含み、この色素が無傷の心臓および線維組織に効率的に浸透したことを示す。さらに、注入されたファロイジンAF649はまた、損傷領域の心筋細胞の心筋細胞およびいくつかの負傷領域の線維芽細胞を募集した。
この実験は、薬物が心外膜を横断し、基礎となる心筋に浸透できることを明らかにする。色素を用いた胸腔内注射の効率を試験した後、心臓に注入されたタンパク質の効果を分析する。このために、外因性サイトカインが種々のプロセスに及ぼす影響を調べる。
心筋細胞増殖の生物学的側面は、細胞外マトリックス沈着、免疫細胞のリクルート、および心保護遺伝子発現がサイトカインの胸腔内注射によって活性化される。これらの結果は、胸腔内注射が、様々なアッセイにおける異なる心臓組織に対する効果を研究するためのタンパク質の標的送達に適した戦略を提供することを示している。心膜への針の挿入は、正常な注射のための重要なステップです。
針の形状、浸透の角度、穿刺部位は、針の挿入に影響を与えるすべての要因です。胸腔内注射に続く、または前に、注入された分子が心臓再生に及ぼす影響を分析するために凍結傷害を行うことができる。胸部注射は、心臓前調整を研究するためにゼブラフィッシュに使用された。
CNTFと呼ばれるタンパク質が注入され、心臓における細胞保護および再生促進プログラムを増強することが示されている。
