この研究は、糖尿病および消化器の国立研究所と腎臓病による青少年糖尿病研究財団の助成金5-2007-97（VEPに）、によってサポートされていました助成金R01DK064973（VEPに）、R01DK48494（LHPに）、T32DK07074（SCEをサポート）、K01DK083552 （MDKに）、そしてシカゴの糖尿病研究研修センターの大学にP60DK20595で。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしもNIDDKまたはNIHの公式見解を表すものではありません。

1。注射前の準備<ol><li>注射前に少なくとも24時間の速い魚。これは腸の電球（胃）の内容を空にします。基本的な空腹時のプロトコルは、クリーンタンクに、彼らの通常の密度で、魚を転送する場合、次に食べ物を差し控える。 （例えば、血糖の研究のための）より厳密な条件を必要とする長期的な断食の場合は、ディスカッションの追加の考慮事項を参照してください。 </li><li>コートランドの塩溶液（ペリーら 、1984）を準備する。 100mLの容積のために、蒸留水に次のように溶かす。 725 mgを塩化ナトリウム（124.1 mM）を 38ミリグラムのKCl（5.1 mM）を 41ミリグラムのNa 2 HPO 4（2.9 mM）を 24mgのMgSO 4を ∙7H 2 O（1.9 mM）を 16mgの塩化カルシウム∙2H 2 O（1.4 mM）を 100mgを飽和NaHCO 3（11.9 mM）を 4グラムポリビニルピロリドン（PVP）（4％） 千USP単位のヘパリン 、フィルタリング滅菌し、4℃で保存します。 </li><li>顕微鏡を準備します。 <ul><li>流出の場合には保護用のプラスチックラップと顕微鏡のベースカバーに入る。 </li><li>ラップの上に紙タオルを置く。手術台にはペーパータオルの上に座ります。 </li><li>手術台の表示やスポンジに焦点を当ててピントを事前に調整する。 </li></ul>ヒント：スポンジの上に指を入れて、それに焦点を当てる。魚が手術台上になるとこれは、焦点調整を排除するか、さらに最小化します。 </li><li>魚の重量を量る。 <ul><li>魚の放熱水との完全な約1 / 3 500mLのビーカーを埋める。 </li><li>天びんをテア。 </li><li>ネットを使って魚を集める。離れて簡単にペーパータオルの上でネットを軽くたたくことによってネットと魚から余分な水分を放出する。ビーカーに魚を移す。 </li><li>魚の重量を量る。 </li><li>きれいな水槽に魚を移す。 </li><li>独自のラベルが付いたタンクにそれぞれ秤量した魚を移す。 </li><li>魚の重量に基づいて、それぞれの魚のための注入量を計算する。 </li></ul></li><li>注射器と関連する噴射装置を準備します。注射のために、我々は35G斜めのスチール針と10μlのNanoFilのマイクロシリンジをお勧めします。製造元の指示に従ってNanoFilシリンジとsilflexチューブを準備します。注射器とチューブからの気泡を除去することが重要です。注射器とチューブを充填した後、ポンプにシリンジをマウントして、プログラムは最初に魚のための注入量を。 </li><li>手術台を準備します。 <ul><li>それは高さが約20mmになるように柔らかいスポンジを（そのような＃L800 - D、Jaece産業など）をカット。平らな面に、深さ10〜15ミリメートルであるカットを行います。このカットは、注射のために魚を保持するトラフです。 </li><li> 60ミリメートルペトリ皿にスポンジを設定します。 </li><li>適切なサイズのピペットチップボックスの蓋にスポンジでシャーレを設定します。蓋は、スポンジの温度を維持するために水を保持するのに十分な大きさでなければなりませんが、それが邪魔にしないように十分な浅いはずです。我々は11.4センチメートルL X 7.7センチメートルW × 1.5 cmのP200チップボックスから蓋を使用してD. </li></ul> （箱のふたのペトリ皿のスポンジ）を一緒に組み立てこれらの3つの項目は、手術台を構成する。 </li><li>麻酔薬を準備します。 <ul><li>魚の施設の水から作られたキューブを使用して砕いた氷を作る。 </li></ul>ヒント：典型的なアイスキューブトレイを使用して、それは10-12の魚を麻酔に3トレイがかかります。 <ul><li>砕いた氷できれいな氷のバケツをいっぱいに。 </li><li>このような2.4リットルラバーメイドの食品保存容器などの大型コンテナに手術台を置く。 </li><li>外側のコンテナと手術台にいくつかの施設の水を（暖かい）注ぐ。暖かい放熱水の予備を近くにしてください。 </li><li>外側の容器の中に温度計を置く。 </li></ul></li></ol> 2。麻酔、注射およびリカバリ<ol><li>麻酔外側のコンテナに加えて顕微鏡に隣接して手術台に置きます。近くの氷片のバケツを持っている。 </li><li> 17に水の温度を下げる° Cの氷のチップを追加することによって。重要：このステップでは17℃以下にしないで下さい。 </li><li>外側の容器に魚を転送するためにネットを使用してください。 </li><li>徐々に12に温度を下げるために容器に氷片を追加° C、数分間にわたり。 </li><li>モニターの魚の挙動：17℃で、またはわずかに低く、魚は一般的に、水平に胸ひれを広げ息を呑む、および迅速な蓋の動きを持っているでしょう。温度が下がると、魚が泳いで停止し、よりゆっくりと最終的に泳ぐになります。麻酔の外科的平面に近づくにつれて、喘ぎが停止し、蓋の動きが遅くなります。それが処理さに反応しないときに魚が注射の準備ができています。ほとんどの魚、12℃の場合はCで十分です。大きい魚は寒いWAが必要な場合がありますTER。 </li><li>必要な温度（〜12 ° Cまたは寒い）に達しているとして、それを飽和させるためにスポンジを押してください。 </li><li>彼らは魚をウォームアップし、取扱い中に麻酔からそれを持っていないことを充分に冷たい水に指を近づけないでください。 </li><li>冷たい指で、軽くスポンジの谷に魚を移す。トラフの上腹部や鰓で魚を置きます。 </li><li>迅速顕微鏡ステージに手術台​​を転送する。 </li><li>素早く作業を、慎重に骨盤のフィンの間の正中線に針を挿入する。針は頭側で示す必要があり、肛門にも近い骨盤に挿入される。あなたは、針が体壁に深いときに感じることができるはずです。適切な量​​を注入し、針を撤回。 </li><li>注入後、直ちにその温水タンクの水を介しスポンジから魚を解放することによって、リカバリ用（〜28.5 ° C）タンクに戻し、魚を移す。 ヒント：魚はすぐに水泳開始されない場合、それは静かに鰓に向かって水を旋回して回復を助ける。 </li><li>針を確認してください。時折スケールが取り付けられてもよいし、次の注入の前に削除する必要があります。 </li><li>その後の注射の場合は、° C、次の魚を導入する前に17に戻すまでの麻酔チャンバーの水の温度を持って暖かい施設の水を使用してください。 </li></ol> 3。代表的な結果： <img src="/files/ftp_upload/2126/2126fig1.jpg" alt="図1" /> 図1は0.5mg / gのグルコースまたは車両の腹腔内注射後の代表的な結果。魚は、注射前72時間絶食させた。 x軸は時間、ポスト噴射を示しています。 ± SEMを意味する。

<ol>
	<li>Perry, S. F., Davie, P. S., Daxboeck, C., Ellis, A. G., Smith, D. G., Hoar, W. S., Randall, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion+methods+for+the+study+of+gill+physiology.">Perfusion methods for the study of gill physiology.</a> Fish Physiology Volume X: Gills, Part B: Ion and Water. , 325-388 (1984).</li><li>Brown, L. A., Stoskopf, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia+and+restraint.">Anesthesia and restraint.</a> Fish Medicine. , 79-90 (1993).</li><li>Eames, S. C., Philipson, L., Prince, V. E., Kinkel, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+sugar+measurement+in+zebrafish+reveals+dynamics+of+glucose+homeostastis.">Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostastis.</a> Zebrafish. 7, 205-213 (2010).</li><li>Chavin, W., Young, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+in+the+determination+of+normal+serum+glucose+levels+of+goldfish+Carassius+auratus+L.">Factors in the determination of normal serum glucose levels of goldfish Carassius auratus L.</a> Comp Biochem Physiol. 33, 629-653 (1970).</li><li>Groff, J. M., Zinkl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematology+and+clinical+chemistry+of+cyprinid+fish.+Common+carp+and+goldfish.">Hematology and clinical chemistry of cyprinid fish. Common carp and goldfish.</a> Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 2, 741-776 (1999).</li><li>Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C., Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+and+raising+zebrafish.">Keeping and raising zebrafish.</a> Zebrafish: A Practical Approach. , 7-37 (2002).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. , (1995).</li><li>Iwama, G. K., Ackerman, P. A., Hochachka, P. W., Mommsen, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaesthetics.">Anaesthetics.</a> Biochemistry and Molecular Biology of Fishes, Volume 3: Analytical Techniques. , 1-15 (1994).</li><li>Reavill, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+diagnostic+and+clinical+techniques+for+fish.">Common diagnostic and clinical techniques for fish.</a> Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 9, 223-235 (2006).</li><li>Stoskopf, M. K., Stoskopf, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgery.">Surgery.</a> Fish Medicine. , 91-97 (1993).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

空腹時、ひょう量、麻酔、注射、および回復：腹腔内注射は、5つのステップが含まれます。各ステップの成功を確保することができるベストプラクティスがあります。成功は、健康な魚の患者だけでなく、良い実験結果が含まれています。 空腹時：24時間の高速は、腸の電球を空にする必要があります。このような行為は、魚獣医文献（例えば、ブラウン1993）から取得されます。追加の空腹時の考慮事項について以下に説明します。 長期的な断食：私たちは、72時間高速で注入する前にベースラインレベルに血糖を減少させるために必要であることを発見した（イームズら 、2010）。我々はまた、グルコースの研究のために魚が適切に絶食していることを保証するために必要とされるいくつかの手順があることを発見した。クリーンタンク（底のない破片）で始まります。タンクは明らかに&quot;断食&quot;というラベル、オフライン状態にしてください、そして場所に熱狂的な魚の医療従事者はそれらを給紙されない場所。タンクの外部環境を評価し、ストレスは血糖を上げるために知られているように、障害から強調されてから魚をしないように対策を講じる（チャビンとヤング、1970;グロッフら 、1999。）。例えば、我々は無線は魚のタンクを持っていたベンチに毎日運営された断食実験していた。我々は、血糖値が異常に高いことが判明し、魚が振動によって強調されたと結論づけた。別のストレッサーは過密です。魚は良い魚飼育慣行に準拠して密度に維持する必要があります。推奨事項については、ブランドらを参照してください。 （2002）とウェスターフィールド（1995）。我々は、9リットルタンク（そのボリュームの一部を占めてビー玉の3層で）10〜12魚の密度で私たちの魚を絶食良い結果を得ています。男女を分離することがストレスの原因となりますので、高速の中に混在性別人口を維持することをお勧めします。これは、卵を配置することができることを意味し、そして卵は、それらが食べされないように隔離する必要があります。卵を隔離するための簡単​​な方法は、大理石の2-3層でタンクの底をカバーするものである。水質は、卵や廃棄物を除去することによって、毎日水槽の水の約10-15％を、置き換えることにより維持される必要があります。サイフォン、卵や廃棄物を除去するに適しています。 ひょう量：麻酔ではない魚を計量するとき、注意が正確な計量を確保するために、ビーカーにネットから水の移動を最小限に抑えるよう注意が必要です。ネットが（魚付き）ペーパータオルにブロットされている場合、余分な水分の大部分は除去することができ、重量を正確に測定することができる。それは前の計量に魚を麻酔する方が簡単かもしれませんが、私たちは一日に二度魚を麻酔の可能性のある影響をテストしていません。我々は、それが麻酔され、ゆっくりと乾燥したブロットした後、魚を再び秤量しネッティング/ブロッティング法を持つ最初の魚を秤​​量し、ことによって私たちの技術をテストしている。我々は、メソッド間の体重に有意差は認められなかった（P = 0.7927、t -検定）。さらに、我々は、単にとすぐに（なしブロッティング）網掛けされているビーカーに魚を移すと比較して、このネッティング/ブロッティング法、影響を受けた血糖かどうかを試験した。我々は2つ​​の転送方法との間の血糖値に有意差は認められなかった（P = 0.2241、t -検定）。 麻酔：化学麻酔は、多くの研究に適している。多くの麻酔薬は、（tricaine/MS-222（ブラウン、1993）を含む）、血糖値を上げるので、ここでは、代替手段として、冷たい水の麻酔を実証した。以前の研究では、私たちは冷たい水が（イームズら 、2010）ゼブラフィッシュで血糖値を上昇させないことを決定した。 冷たい水の麻酔の場合は、温度を徐々に減少させるべきである。減少率は小さい魚が大きな魚よりも高速で行くと、魚の大きさに依存するようです。注入に続いて、魚は麻酔薬（下記参照）から、あまりにもゆっくりと回復していることが観察される場合があります。開始温度が低すぎる場合、または温度があまりにも急激に減少しているときにどちらかこれが発生する可能性があります。開始温度は、水に入ると魚が曲がる場合横方向に低すぎる。開始温度が正しければ、魚は最初にそのバランスを維持します。それは、水平の位置にその胸ひれを回して息をのむ、および迅速な蓋の動きを持つことになります。一般的に、それは泳ぐだろう。温度が減少すると、動きが減少し、魚は平衡を失うことになる。魚が反応することなく処理できるときに麻酔の外科平面に到達する。手術の麻酔下で魚を維持するために、あなたの指は、寒くなるので、魚を処理する前に水でそれらを維持する必要があります。スポンジは、魚を麻酔に使用される水と同じ温度で低温に保たれている必要があります。 sufficieである水とスポンジを飽和することが重要です。魚はその上に配置されると、麻酔を維持するためにntly寒い。 注射：前着手注射に、あなたが体壁の厚さの感覚を得るために少なくとも1つの魚を解剖したい場合があります。これは、針が腹腔を入力するように挿入する必要がどこまで判断することができます。さらに、針を挿入するように、針が腹腔内に入ると体壁は、&quot;与える&quot;感じることができる。注入中に、患者を満足させるための手順を実行します。スポンジを注入中に復活するから魚を防ぐために、正しい温度冷たい水で飽和されていることを確認します。よく飽和と柔らかいスポンジは、スケールと、皮膚の被覆粘液へのダメージを最小にするために重要です。よく飽和スポンジはエラが通気保つためにも重要です。我々は、非常に材料の下に、下記のフォームスポンジをお勧めします。最後に、一度魚が麻酔か、魚が下になる時間を最小限に抑えるために迅速に働く。 回復：魚は暖かい水槽の水に入ると実質的に麻酔から回復する必要があります。魚はえらに向かって静かに渦巻く水の回復を高速化するために、すぐに水泳を開始していない場合。回復が遅い場合は、その後、魚が余りにすぐに下に行き、あなたが適切に麻酔の手順を調整する必要があります。緩やかな回復の可能性のある原因は、麻酔下で説明されています。

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Foam Sponge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jaece Industries</td>
<td>L800-D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>60 mm Petri dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pipet tip box lid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>not too deep, e.g. 1.5 cm</td>
</tr>
<tr>
<td>Plastic storage container</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>deep, e.g. 7 cm </td>
</tr>
<tr>
<td>Thermometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Crushed ice</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>made from facility water</td>
</tr>
<tr>
<td>Warm facility water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1 liter or more</td>
</tr>
<tr>
<td>500 ml beaker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>for weighing</td>
</tr>
<tr>
<td>NanoFil syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
<td>NANOFIL</td>
<td>or Hamilton syringe</td>
</tr>
<tr>
<td>35 gauge needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>NF35BV-2</td>
<td>beveled</td>
</tr>
<tr>
<td>Silflex tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>SILFLEX-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>UltraMicroPump III and Micro4 controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>UMPS-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Foot switch</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>15867</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic wrap</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paper towels</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cortland salt solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

intraperitoneal injection into adult zebrafish

化学的にゼブラフィッシュを治療するための便利な方法は、それが魚に取り込まれるタンクの水に試薬を導入することである。しかし、この方法では、それが困難な試薬が吸収されるか、または魚ごとに取り上げているどのくらい知っています。特にいくつかの実験的な質問、代謝の研究に関連するものが、より重量に基づいて、それぞれの魚に定義された量を提供することで対処することができます。ここでは、成人のゼブラフィッシュに腹腔内（IP）注入のための手法を提案する。注射は、腹腔内に骨盤に後方である。この手順は、より大きい魚のために使用される獣医の方法から構成されている。我々はゼロの死亡率を観察しているとして、それは、安全です。さらに、我々は127の注射だけうち5における注射部位の出血を見てきました、そしてそれらのそれぞれの場合に出血は簡単な、持続数秒であり、失われた血液の量が少なかった。この手順での成功は、麻酔、注射、および回復の重量を量る、空腹時を含めていくつかのステップを通じて、魚の穏やかな処理が必要です。注意事項は、プロシージャ全体でストレスを最小限にするために必要です。私たちの注意事項は、小さな注入量と35Gの針を使用して含まれています。我々は、浸透淡水魚のために釣り合っている車両、としてコートランドの塩溶液を使用してください。鰓の通気は、注射自体の間に水で飽和したスポンジの中トラフで魚を保持することによって、最初の手術が遅い蓋の動きを可能にする麻酔の飛行機、、第二に、魚を持って来ることによって注入手順の間に維持されます。我々は、グルコースを注入し、血糖値の上昇と正常にその後の復帰を監視することによって、IP注射の有用性を実証する。ストレスが魚類の血糖値を高めるために知られているように、我々は車両の注入および非注入成人で血糖値を比較すると手続きが血糖値の有意​​な上昇が発生しないことを示している。

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Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

我々は、成体ゼブラフィッシュに腹腔内注射を示しています。我々はMicro4コントローラとUltraMicroPump IIIによって制御される10μlのNanoFilマイクロシリンジを使用してください。このデモでは、麻酔薬として冷たい水の使用が含まれています。

アダルトゼブラフィッシュへの腹腔内注射

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

intraperitoneal-injection-into-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

56.8K ビュー.  The University of Chicago. 我々は、成体ゼブラフィッシュに腹腔内注射を示しています。我々はMicro4コントローラとUltraMicroPump IIIによって制御される10μlのNanoFilマイクロシリンジを使用してください。このデモでは、麻酔薬として冷たい水の使用が含まれています。

ビデオ: Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

アダルトゼブラフィッシュの全腎骨髄の移植

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

生物学

Injection of dsRNA into Female A. aegypti Mosquitos

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the James lab to inject dsRNA into female A. aegypti mosquitoes, which harbor the dengue virus.  The technique for calibrating injection needles, manipulating the injection setup, and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the James lab to inject dsRNA into female A. aegypti mosquitoes, which harbor the dengue virus. The technique for calibrating injection needles, manipulating the injection setup, and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

女性A.ネッタイシマカのモスキートへのdsRNAの注射

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Zebrafish Brain Ventricle Injection

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved cavities within the brain that are filled with cerebrospinal fluid.  In zebrafish, after neural tube formation, the neuroepithelium undergoes a series of constrictions and folds while it fills with fluid resulting in brain ventricle formation.  In order to understand the process of ventricle formation, and the neuroepithelial shape changes that occur at the same time, we needed a way to visualize the ventricle space in comparison to the brain tissue.  However, the nature of transparent zebrafish embryos makes it difficult to differentiate the tissue from the ventricle space.  Therefore, we developed a brain ventricle injection technique where the ventricle space is filled with a fluorescent dye and imaged by brightfield and fluorescent microscopy.  The brightfield and the fluorescent images are then processed and superimposed in Photoshop.  This technique allows for visualization of the ventricle space with the fluorescent dye, in comparison to the shape of the neuroepithelium in the brightfield image.  Brain ventricle injection in zebrafish can be employed from 18 hours post fertilization through early larval stages.  We have used this technique extensively in our studies of brain ventricle formation and morphogenesis as well as in characterizing brain morphogenesis mutants (1-3).

After neural tube formation, the neuroepithelium constricts and folds while the tube fills with embryonic cerebrospinal fluid (eCSF) to form the embryonic brain ventricles. We developed this ventricle injection technique to better visualize the fluid filled space in contrast to the neuroepithelial shape in a live embryo.

ゼブラフィッシュの脳室注入

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is often the most effective and noninvasive form of delivery of an agent of interest. In the zebrafish (Danio rerio), IV injection of drugs has long been a challenge because of the small vessel diameter. This has also proved a significant hurdle for the injection of cells during hematopoeitic stem cell transplantation. Historically, injections into the bloodstream were done directly through the heart. However, this intra-cardiac procedure has a very high mortality rate as the heart is often punctured during injection leaving the fish prone to infection, massive blood loss or fatal organ damage. Drawing on our experience with the mouse, we have developed a new injection procedure in the zebrafish in which the injection site is behind the eye and into the retro-orbital venous sinus. This retro-orbital (RO) injection technique has been successfully employed in both the injection of drugs in the adult fish as well as transplantation of whole kidney marrow cells. RO injection has a much lower mortality rate than traditional intra-cardiac injection. Fish that are injected retro-orbitally tend to bleed less following injection and are at a much lower risk of injury to a major organ like the heart. Further, when performed properly, injected cells and/or drugs quickly enter the bloodstream allowing compounds to exert their effect on the whole fish and kidney cells to easily home to their niche. Thus, this new injection technique minimizes mortality while allowing efficient delivery of material into the bloodstream of adult fish. Here we exemplify this technique by retro-orbital injection of Tg(globin:GFP) cells into adult casper fish as well as injection of a red fluorescent dye (dextran, Texas Red ) into adult casper fish. We then visualize successful injections by whole animal fluorescence microscopy.

Here we show how to do retro-orbital injection in adult zebrafish.

アダルトゼブラフィッシュにおける眼窩インジェクション

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

アダルトゼブラフィッシュからの臓器の解剖

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the eye, brain, and somites of zebrafish. The advantage of electroporation over other methods of genetic manipulation is that specific tissues can be targeted, both spatially and temporally, for the introduction of macromolecules by the application of electrical current. Here we describe the use of electroporation for transfecting mif and mif-like morpholinos into the tissues of the developing inner ear of the zebrafish. In past studies, mif morpholino injected into embryos at the 1- to 8-cell stage resulted in widespread morphological changes in the nervous system and eye, as well as the ear. By targeting the tissues of the inner ear at later stages in development, we can determine the primary effects of MIF in the developing inner ear, as opposed to secondary effects that may result from the influence of other tissues. By using phalloidin and acetylated tubulin staining to study the morphology of neurons, neuronal processes, and hair cells associated with the posterior macula, we were able to assess the efficacy of electroporation as a method for targeted transfection in the zebrafish inner ear. The otic vesicles of 24hpf embryos were injected with morpholinos and electroporated and were then compared to embryos that had received no treatment or had been only injected or electroporated. Embryos that were injected and electroporated showed a decrease in hair cell numbers, decreased innervation by the statoacoustic ganglion (SAG) and fewer SAG neurons compared with control groups. Our results showed that direct delivery of morpholinos into otocysts at later stages avoids the non-specific nervous system and neural crest effects of morpholinos delivered at the 1-8 cell stage. It also allows examination of effects that are directed to the inner ear and not secondary effects on the ear from primary effects on the brain, neural crest or periotic mesenchyme.

A method to deliver morpholinos directly into the zebrafish otocyst at 24hpf has been developed. Using microinjection of morpholinos into the lumen of otic vesicle and electroporation to effect penetration, we were able to bypass the effect of morpholinos on the brain and obtain effects specific to the inner ear.

注射とエレクトロポレーションによりゼブラフィッシュ耳胞イントゥMIFモルフォの直接配信は、内耳の開発に影響を与える

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

直接アダルトゼブラフィッシュの腎臓への細胞の移植

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

アダルトゼブラフィッシュ腎臓の解剖

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

アダルトゼブラフィッシュ網膜にモルフォの in vivoエレクトロポレーションに

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

リジェネアダルトゼブラフィッシュテールフィンにMorpholinos の in vivoエレクトロポレーションで

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...