徐々に過去10年間に成人のゼブラフィッシュでこの解剖の技術を形成してきた戦略を開発する助けに彼らの無数の貢献のためゾンとデビッドソンの研究室のメンバーに感謝するRAW願い。さらに、我々はゼブラフィッシュのコロニーのための優秀な継続的な畜産のケアを提供するためのゼブラフィッシュ研究のためのノートルダムセンターのスタッフメンバーに感謝の意を申し上げます。 RAWは、NIH - NIDDK助成賞DK083512から研究資金を獲得し、そしてノートルダム大学からの寛大な研究室では、スタートアップ資金調達。

1。固定されていない動物のサンプルから大人のゼブラフィッシュの腎臓の解剖<ol><li>解剖のための年齢の3〜6ヵ月の間に大人のゼブラフィッシュを選択してください。 </li><li>エラが動いて停止し、心臓が鼓動を停止することを確認して慎重に見て、約4-5分の0.2％Tricaine pH 7.0の皿にそれを置くことによって魚を安楽死させる。 </li><li>スプーンを使用して、少量の溶液でTricaine槽から魚を持ち上げて、ソリューションをデカントし、軽くペーパータオル上で動物を置きます。 </li><li>ちょうど鰓蓋（図1、パス）の後ろにカットをする、動物の頭を削除するには、解剖ハサミを使用してください。バイオハザード廃棄物容器の頭部を捨てる。 </li><li>頭から開始し、尾鰭（図1、経路B）の基部にある尾で終了、長い腹側切開を行うことによって、動物の身体を開くために解剖鋏を使用してください。 </li><li>解剖ピンセット/鉗子のペアを使用して、動物の内臓を外し、バイオハザード廃棄物の中に置いてください。これは腎臓の位置（図2）であるとして、背側体壁を磨くように注意してください。あなたがメスの魚を選択した場合は、最も簡単に鉗子やピンセットの角度のペアを使用して行うことができます体腔、の開発卵をかき出すする必要があります。 </li><li>解剖トレイに体の壁を開きピン、および腎臓が可視化できるようにピンを角度に解剖針を使用してください。腎臓には黒い色のついた色素（図2）に散在して、特徴的な形状（頭部、トランク/サドル、テール）と色を持つようになる。また、臓器の構造の正中線を下に実行される末梢血で満たされた大動脈を、表示されることがあります。 </li><li>あなたがそれを根底にある結合組織から臓器を分離するように腎臓を持ち上げるために鉗子の一組を使用して、背側体壁から腎臓をデタッチするには微細な鉗子を使用してください。 </li><li>静かにそのようなFACSの調製のための1X PBSを含むマイクロチューブのようなさらに、生細胞の研究、のために必要な車両に腎臓を置きます。 </li></ol> 2。固定動物サンプルから大人のゼブラフィッシュの腎臓の準備と解剖<ol><li> 4パーセントparaformaldehyde/1XのPBSTの溶液を調製します。溶液中にPFAを溶解するためのソリューションを沸騰させて、その後4℃に混合物を冷却し、0.1％ジメチルスルホキシドを追加します。我々は、冷凍アリコートとは対照的にたてPFAのソリューションを使用してから組織保存で最も成功を収めている。水没解剖時の大人ゼブラフィッシュのに十分なソリューションとなります。 </li><li>水没解剖時の大人ゼブラフィッシュのに十分な固定液で解剖トレイを埋める。我々は、固定の匂いへの曝露を最小限に抑えるために、化学フードに置くことができる顕微鏡下に置かこのトレイ、後続の手順を実行します。 </li><li>解剖のための年齢の3〜6ヵ月の間に大人のゼブラフィッシュを選択してください。 </li><li>エラと心臓の停止が鼓動ことを確認して慎重に見て、約5分間の0.2％Tricaine pH 7.0の皿にそれを置くことによって魚を安楽死させる。 </li><li>スプーンを使用して、少量の溶液でTricaine槽から魚を持ち上げて、ソリューションをデカントし、軽くペーパータオル上で動物を置きます。 </li><li>ちょうど鰓蓋（図1、パス）の後ろにカットをする、動物の頭を削除するには、解剖ハサミを使用してください。バイオハザード廃棄物容器の頭部を破棄し、そして即座にPFA含有解剖トレイに動物を配置。 </li><li>頭から開始し、尾鰭（図1、経路B）の基部に尾で終了する、長い腹側切開を行うことによって、動物の身体を開くために解剖鋏を使用し、そして部分的に中に没水体を維持する手続き。 </li><li>解剖ピンセット/鉗子のペアを使用して、動物の内臓を外し、バイオハザード廃棄物の中に置いてください。これは腎臓の位置（図2）であるとして、背側体壁を磨くように注意してください。 </li><li>体の壁を開放ピン、および腎臓が可視化できるようにピンを角度に解剖針を使用してください。腎臓には黒い色のついた色素（図2）に散在して、特徴的な形状（ヘッド、サドル、テール）と色を持つようになる。また、臓器の構造の正中線を下に実行される末梢血で満たされた大動脈を、表示されることがあります。 </li><li> 4 ° Cあなたが希望するサンプルのアレンジで行われている時にトレイを置き、一晩サンプルを修正。 </li><li>翌日、トレイからPFA液を除去し、1 × PBSTで交換してください。 </li><li>慎重にあなたがそれを根底に、結合組織から臓器を分離するように腎臓を持ち上げるために鉗子の一組を使用して、背側体壁から腎臓をデタッチするには微細な鉗子を使用してください。腎組織は、それが可能な一体で全体の腎臓の臓器を分析すること、固定液中のDMSOから柔らかく、しなやかになります。 </li><li>使用して、ワイドをマイクロ遠心チューブに腎臓を配置するボア転送ピペット。 </li><li>腎臓は、今必要な調査に基づいて、 その場の遺伝子発現研究に組織学的または全体のマウントを行うためにさらに処 ​​理することができます。 </li></ol> 3。代表的な結果： 図1に図示されている手順では、解剖の手順を示している。図2に示すように、腎臓は、その特徴的な形と色合い、そして動物の体腔の背壁に解剖学的位置に基づいて識別することができます。固定腎標本の解剖した後、in situハイブリダイゼーション全体のマウントは、図3に示すように、目的の遺伝子の発現をローカライズするために使用することができます。 <img src="/files/ftp_upload/2839/2839fig1.jpg" alt="図1"/> 図1：ゼブラフィッシュ成体の腎臓を解剖するためのダイレクトアクセスを可能にする手順。 （A）安楽死ゼブラフィッシュは、研究者に完全な腎臓の臓器への簡単なアクセスを与えるために（数字と矢印で示される）段階的に解剖されています。腹腔内の画像の前に（B）と後（C）腹部臓器の除去。 <img src="/files/ftp_upload/2839/2839fig2.jpg" alt="図2"/> 図2：固定されていないサンプルのゼブラフィッシュ腎臓の可視化は、体腔内の臓器の除去に続いて、腎臓は、結合組織を介して背側体壁（）への付着である単一の統合器官として表示され、図式されています（B）、その解剖学的形状を示す。 <img src="/files/ftp_upload/2839/2839fig3.jpg" alt="図3"/> 図3：全体の成人の腎臓の臓器で実行サイチュハイブリダイゼーションの全マウント。 （）cadherin17転写物は、（&#39;）で拡大し、成人の腎臓のネフロンの尿細管で検出されています。（B）mafbaの転写物が（パネル全体この中で尿細管と比較）成人腎臓における近位ネフロンの細胞型をローカライズしている。（B&#39; ）mafba 式の拡大図は、その転写物は、特に血液フィルター（糸球体）と近位尿細管（PCT）の足細胞（P）を細胞に局在していることを示します。

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C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mesonephric+development+and+regeneration+using+transgenic+zebrafish.">Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).</li><li>Diep, C. Q., Ma, D., Holm, T., Naylor, R., Arora, N., Wingert, R., Bollig, F., Djordjevic, G., Lichman, B., Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+adult+nephron+progenitors+capable+of+kidney+regeneration+in+zebrafish.">Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish.</a> Nature. 470, 95-100 (2011).</li><li>Traver, D., Paw, B. H., Poss, K. D., Penberthy, W. T., Lin, S., Zon, L. 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I., Traver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+kidney+stromal+cell+lines+support+multilineage+hematopoiesis.">Zebrafish kidney stromal cell lines support multilineage hematopoiesis.</a> Blood. 114, 279-289 (2009).</li><li>North, T. E., Goessling, W., Walkley, C. R., Lengerke, C., Kopani, K. R., Lord, A. M., Weber, G. J., Bowman, T. V., Jang, I. H., Grosser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostaglandin+E2+regulates+vertebrate+haematopoietic+stem+cell+homeostasis.">Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis.</a> Nature. 447, 1007-1011 (2007).</li><li>Wingert, R. A., Selleck, R., Yu, J., Song, H. D., Chen, Z., Song, A., Zhou, Y., Thisse, B., Thisse, C., McMahon, A. P., Davidson, A. 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利害の衝突は宣言されません。

成体幹細胞は成人の体の形態1を維持する動的かつ不可欠なコンポーネントです。成体幹細胞はまた、疾患の状態の間に身体が被るそのダメージを打ち消すために役立つことができる、と成体幹細胞の機能不全または損失は、臓器機能の低下につながる可能性と癌の悪性腫瘍を促進し、老化に寄与することが示唆されている。成体幹細胞は分化した細胞型と区別する細胞の性質を示す。細胞分裂時には、成体幹細胞は自己複製し、順番に明確な差別化された子孫を生じさせることができる前駆細胞の製造が可能です。ために組織の恒常性1のそれらの重要な役割の成体幹細胞の細胞運命の決定及び効力を調節する経路を理解する上で大きな関心があります。例えば、多くの科学者は現在、ニッチの様々な成体幹細胞集団、または特殊な微小環境、そしてどのようにこのニッチは液性因子によって影響を受けるの維持信号を識別する為に使われます。 成人造血幹細胞（HSC）は、燃料、動物8の血液細胞の継続的な若返り多能性細胞である。造血は、成熟、分化血液細胞の種類は短命であり、そのために定期的に補充する必要があるため、脊椎動物の生物の寿命の間に絶えず継続されて活気のあるプロセスです。彼らは分けるように、造血幹細胞は自己再生すると赤血球、巨核球リンパ球と骨髄系の系統を生じさせる前駆細胞のシリーズを生産することによってこの重要な需要を供給する。これらの血液細胞型の各々は、組織への血餅形成の手段、または病原体の侵入に対する防御機構によって血管に傷害をシールするための方法をガス交換を提供するなど、循環のユニークな機能を実行します。造血幹細胞が長年にわたって認識されているが、魅惑的な質問の茄多は、これらの驚くべき細胞について未回答のままである。最近の研究では異なる長期的な自己複製のプロパティ、およびニッチの構成要素とHSC動作8を調節するシグナルの解明と造血幹細胞のサブクラスを同定した。ゼブラフィッシュは、この動物モデル8の遺伝子や分子属性に基づいて、造血の研究パラダイムの礎石の間で今である。ゼブラフィッシュを活用した研究は、魚の血液の調査8の生物医学的妥当性を強調し、哺乳類のような高等脊椎動物で保存されているHSC生物学についての小説洞察につながっている。 歴史的に、造血幹細胞についての知識は他の身体器官は成体幹細胞によって維持されているかどうかを調べるに求めて遠征するための道を開きました。多数の成体幹細胞集団は現在、脳から腸、皮膚、および骨格筋に多様な構造を介してまで、存在に感謝している。幹細胞分野における継続的な努力は、成体幹細胞、さらには他の分化細胞型は、様々な場面で強化された効力を表示する方法を識別する為に使われます。 腎臓に関しては、腎幹細胞が16存在するかどうかの腎臓専門医の間で大きな議論があった。独立した調査結果は、再生可能性の度合いを持つ哺乳類の腎臓細胞の集団を文書化しているが、これらの報告の凝集理解が達成されていない。興味深いことに、多くの魚種が確実に損傷ネフロンの再生に燃料を供給するだけでなく、成人期9中に全く新しいネフロンを育てることができる細胞を有しているという考えを支持する強い証拠がある。最近の研究は、ゼブラフィッシュ10,11で成人の腎臓の幹細胞の分子の特徴を識別し、これらのいわゆる腎幹細胞/前駆細胞（RPC）の11の自己再生能を実証した。今後の研究は、類似した腎細胞が哺乳類に存在するかどうかを確認するために必要とされる。それにもかかわらず、魚のRPCを調節する細胞および分子メカニズムに関する継続的な調査は、哺乳類の腎臓に刺激することができる方法回生偉業への洞察を提供することがあります。それは多くのRPCをについて理解することが残っている、とゼブラフィッシュの研究者に現在利用できる多くのツールがこれらの魅力的な疑問に取り組むために実装できることは明らかである。 このプロトコルでは、我々は大人のゼブラフィッシュの腎臓の解剖学的同定と郭清のための私達の方法を説明します。代替手順は、解剖用鋏を用いて腹部切開で腹腔を開くと、腎臓を解剖するために使用することができますが、我々は腹壁が開いて固定されているときに全体の腎臓へのアクセスで最も成功が発生しているとヘッドが削除されます。これらの細胞型と分離して作業したい問わず血液と腎臓の研究者が解剖の方法のいずれかを使用できます。なお、その単離及びワーキンために我々が記述する方法ゼブラフィッシュ成体の腎臓とgは確かにこの器官の解剖は、生理学から老化に至るまでのトピックの調査を追求するそれらの研究者のための研究を促進することができるように、成体幹細胞生物学の問題を追求する科学者に限定されません。さらに、この方法は分子的にラベル付けし、野生型または遺伝子変異ゼブラフィッシュ11から血液や腎臓の細胞の離散部分母集団を浄化して勉強するように、このような遺伝子組換えなどの他の技術と組み合わせて使用することができます。このような移植または前駆培養などの運用テストは、これらの細胞の効力とアイデンティティが定義されていることによって基礎を構成するように楽しみにして、幹細胞や前駆細胞型のような詳細な精製方法は、彼らの行動が規制される方法についての知識を得るために不可欠です。造血前駆細胞の培養法における最近の進歩は研究のための多くの新たな道を開き、腎人口17の培養に適合させることができる。ゼブラフィッシュの化学遺伝学は、さまざまなコンテキスト18-20に造血幹細胞および腎前駆細胞を調節する経路の同定に成功している、と上記の細胞生物学の技術と組み合わせてテストする便利な手段であり続けるだろう。一緒になって、ゼブラフィッシュモデルを使用して血液と腎臓の分野に画期的な貢献の数があった、とこれらの分野で研究を続け、今後数年間で振るうさらなる変革洞察することを約束。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><td>解剖はさみ</td><td> Roboz </td><td> RS - 5882 </td></tr><tr><td>解剖の鉗子</td><td> Roboz </td><td> RS - 5010 </td></tr><tr><td>解剖角度鉗子</td><td> Roboz </td><td> RS - 5058 </td></tr><tr><td> Tricaine </td><td>シグマ</td><td> E10521 </td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>電子顕微鏡サービス</td><td> 19210 </td></tr></tbody></table>

dissection of the adult zebrafish kidney

成体幹細胞生物学の急成長分野で働く研究者は、通常のホメオスタシスと疾患状態の間に幹細胞の挙動と機能を調節するシグナルを理解しよう。成体幹細胞の理解は、再生医療1の将来のための広範な到達意味を持っています。例えば、成体幹細胞の生物学についてのよりよい知識は臓器が自分自身を癒したり、人間の1に移植することができるin vitroで成長している臓器のためのメソッドの作成 ​​にトリガーされる治療戦略の設計を容易にすることができます。ゼブラフィッシュは、脊椎動物の細胞生物学2の研究のための強力な動物モデルとなっている。ゼブラフィッシュ3の胚発生の豊富なドキュメントと分析がなされている。成人の研究に本研究の生物の用途拡大をゼブラフィッシュコミュニティ内で進歩的な動きがあったとして、ごく最近になって、文書の成人の解剖学に求められる科学者や外科解剖の技法4を持っている。例えば、成体幹細胞集団の生物学を調査し、がんなど5のような疾患の洗練された大人のモデルを作るためにゼブラフィッシュを用いての関心をそこに展開しています。歴史的に、ゼブラフィッシュ成体の腎臓の分離は、腎臓が魚6,7の血液細胞の産生の解剖学的位置であるため、造血を研究するために尽力している。腎臓は、間にスペースを各所に分散している造血組織に囲まれ、樹状の手配に見られるネフロンの機能ユニットで構成されています。造血コンポーネントは、末端に8を差別化するまで、腎臓に生息している造血幹細胞（HSC）およびその子孫で構成されています。さらに、それは現在腎臓幹細胞/前駆細胞（RPC）のグループはまた、ゼブラフィッシュ腎臓の臓器に生息し、など、他の魚種9-11に見られるように、腎臓の再生と成長の両方を有効にすることが理解される。この新発見の光の中で、ゼブラフィッシュ腎臓は、成体幹細胞生物学研究のための2つのエキサイティングな機会の場所を収容するの臓器です。それは多くの未解決の質問はよくこの実験的なシステムで提供できることが明らかである。このフィールドの拡大を奨励するために、それは視覚化の詳細な方法を文書化してから、成人のゼブラフィッシュの腎臓の臓器を分離することは有益である。このプロトコルは、固定されていないと固定の両方の動物からの成体腎臓の解剖の詳細私たちの手順を。腎臓の臓器の解剖は、組織学、蛍光活性化細胞選別（FACS）11,12、発現プロファイリング13,14、および移植11,15として確立された技術を用いて造血と腎幹細胞とその子孫を分離し、特徴付けるために使用することができます。我々は、このプロトコルのその普及が最終的に人間のアプリケーションに変換できるゼブラフィッシュの研究のより広い使用を実装するための知識を研究者に提供することを願っています。

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Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

ゼブラフィッシュの腎臓は、腎臓および造血両方成人の幹細胞/前駆細胞の本拠地であり、これらの細胞型と脊椎動物のモデル生物でそれらの子孫を研究する優秀な機会を表しています。ここでは、このような細胞の単離、移植、および腎臓および/または血液細胞集団の発現の研究​​などのアプリケーションに使用することができる大人のゼブラフィッシュの腎臓を、特定し、外科的に除去する研究者を可能にする詳細な解剖の手順を示しています。

アダルトゼブラフィッシュ腎臓の解剖

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

Research

JoVE Journal

Biology

36.5K ビュー.  University of Notre Dame. ゼブラフィッシュの腎臓は、腎臓および造血両方成人の幹細胞/前駆細胞の本拠地であり、これらの細胞型と脊椎動物のモデル生物でそれらの子孫を研究する優秀な機会を表しています。ここでは、このような細胞の単離、移植、および腎臓および/または血液細胞集団の発現の研究​​などのアプリケーションに使用することができる大人のゼブラフィッ...

ビデオ: Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

アダルトゼブラフィッシュの全腎骨髄の移植

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

生物学

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

アダルトゼブラフィッシュの内耳感覚上皮のグロスとファイン解剖（ゼブラフィッシュ）

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

アダルトゼブラフィッシュからの臓器の解剖

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

アダルトゼブラフィッシュへの腹腔内注射

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

直接アダルトゼブラフィッシュの腎臓への細胞の移植

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work examining post-embryonic through adult cardiac development has been limited7-10. Examining the changing morphology of the maturing and aging heart are restricted by the lack of techniques available for staging and isolating juvenile and adult hearts. In order to analyze heart development over the fish's lifespan, we dissect zebrafish hearts at numerous stages and photograph them for further analysis11. The morphological features of the heart can easily be quantified and individual hearts can be further analyzed by a host of standard methods. Zebrafish grow at variable rates and maturation correlates better with fish size than age, thus, post-fixation, we photograph and measure fish length as a gauge of fish maturation. This protocol explains two distinct, size dependent dissection techniques for zebrafish, ranging from larvae 3.5mm standard length (SL) with hearts of 100&mu;m ventricle length (VL), to adults, with SL of 30mm and VL 1mm or larger. Larval and adult fish have quite distinct body and organ morphology. Larvae are not only significantly smaller, they have less pigment and each organ is visually very difficult to identify. For this reason, we use distinct dissection techniques.
We used pre-dissection fixation procedures, as we discovered that hearts dissected directly after euthanization have a more variable morphology, with very loose and balloon like atria compared with hearts removed following fixation. The fish fixed prior to dissection, retain in vivo morphology and chamber position (data not shown). In addition, for demonstration purposes, we take advantage of the heart (myocardial) specific GFP transgenic Tg(myl7:GFP)twu34 (12), which allows us to visualize the entire heart and is particularly useful at early stages in development when the cardiac morphology is less distinct from surrounding tissues. Dissection of the heart makes further analysis of the cell and molecular biology underlying heart development and maturation using in situ hybridization, immunohistochemistry, RNA extraction or other analytical methods easier in post-embryonic zebrafish. This protocol will provide a valuable technique for the study of cardiac development maturation and aging.

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

A clear, standardized method for dissection and isolation of the zebrafish heart at multiple developmental stages are described. Annotation and quantification techniques are also discussed.

幼虫の心臓の解剖、少年と大人ゼブラフィッシュ、ゼブラフィッシュ</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

アダルトゼブラフィッシュ網膜にモルフォの in vivoエレクトロポレーションに

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

リジェネアダルトゼブラフィッシュテールフィンにMorpholinos の in vivoエレクトロポレーションで

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavagingアダルトゼブラフィッシュ

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

大人のゼブラフィッシュの腎臓におけるネフロン構成と機能の解析

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...