アルファ-シヌクレイン前形成フィブリルモデルは、シヌクレノパチーを研究するために世界中の研究室で使用されています。このモデルは多くの研究室でうまく使用されていますが、一部のグループではフィブリルを生成し、一貫したα-シヌクレイン病理を産生する矛盾を経験しています。我々は、α-シヌクレイン単量体からのフィブリルの生成と生体内での事前形成されたフィブリルの使用を詳述するこのプロトコルが、研究者がモデルの使用に関して持っている質問に答えることができることを願っている。
Α-シヌクレイン前形成フィブリルモデルは、α-シヌクレイン病理および神経変性などのパーキンソン病の主要な特徴を再現する。そして、それはいくつかの動物モデルで控えめな運動障害につながることを示されています。リン酸化α-シヌクレインおよび神経変性に向けた長引く時間経過を含む封入物の形成は、研究者にシヌクレノパシーの進行を通じて異なる段階を提供し、潜在的な治療介入の研究および標的となる。
カスタムガラス針の準備を実証する、私たちのラボ技術者、クリストファー・ケンプです。この手順を開始するには、氷の上にアルファシヌクレインモノマーを解凍します。チューブを軽くフリックして解凍したモノマーを再びサスペンしました。
そして、15,000gと摂氏4度で10分間遠心分離機。次いで、上清をクリーンな1.5mLマイクロ遠心管に移し、移された量を記録する。1x dPBSでモノマーを希釈し、1mL当たり5mgの最終濃度にします。
短く渦を混合し、かつ簡単に遠心分離機をチューブの底にある液体のすべてを収集する。次に、粘着フィルムを用いてマイクロ遠心チューブ蓋を密閉する。1,000 rpmで振りながら、37°Cで7日間蓋をした軌道サーモミキサーにチューブを入れます。
7日間の終わりに、チューブの内容物は濁って見えるはずです。まず、手袋、ラボコート、フェイスシールドなど、必要な個人用保護具をすべて着用してください。次に、細胞培養フードに、直径3.2mmのプローブをコンバーターに取り付けます。
超音波処理器の振幅を30%に設定し、パルスを1秒、1秒オフ、時間を1分に設定します。常温でフィブリルを解凍し、培養フードに残っている間に、滅菌dPBSでフィブリルを希釈する。次に、70%エタノールでラボ組織を湿らせた後、これを使用して超音波処理器のプローブを拭いてきれいにします。
プローブの先端を二重の歪んだ水に沈め、パルスを10回にしてプローブをさらに洗浄します。この後、プローブをラボ組織で拭き取ります。洗浄したプローブチップを希釈したフィブリルのチューブに入れ、先端をチューブの底に置きます。
液体中のすべてのフィブリルが超音波処理されるように、各パルスの間にプローブを上下に動かしながら、以前に設定されたパラメータを使用して希釈されたフィブリルを超音波処理します。超音波処理の後、チューブの側面からすべての液体を収集するために2,000 gで1秒間の短い遠心分離。プローブチップを1%SDSに沈め、パルスを10回パルスしてプローブを洗浄します。
その後、SDSから先端を取り出し、二重蒸留水に沈め、10回パルスします。70%エタノールで湿らせたラボ組織でプローブを拭き、乾燥したラボ組織で乾燥させて拭きます。プローブをコンバーターからデタッチし、ストアを保管します。
この後、フード内のすべての表面を1%SDSで拭き取り、その後に70%エタノールを使用します。まず、シリコンガラスキャピラリーチューブをガラス針の引き手に入れます。発熱体をオンにし、取り付けた重みを加熱したガラスキャピラリーチューブに伸ばします。
次に、はさみを使用して、中央の最も薄いポイントで引っ張られたガラスの毛細管チューブを切断し、ガラス針の引き手からガラス針を取り除きます。その後、はさみを使用してシュリンクラップチューブの長さを約40mmにカットします。10マイクロリットルのベベリングシリンジの金属針の上にシュリンクラップをスライドさせます。
開いた炎を使用して、針にシュリンクラップを加熱し、加熱を均等に適用するために針を回転させます。引っ張られたガラスの針の大きな端をシリンジの金属針の上に注意深くスライドさせます。その後、シュリンクラップチューブの長さを約40mmにカットし、ガラス針の上に慎重にスライドさせて、ガラス針のベースとシリンジの金属針を重ね合わせています。
開いた炎を使用してシュリンクラップを加熱し、ガラス針を金属針に固定します。さらに針を固定し、潜在的な漏れを防ぐために、約40mmにシュリンクラップチューブの追加の長さをカットし、慎重にガラス針の上にスライドさせて、ガラス針のベースとシリンジの金属針を重ね合わせて下さい。開いた炎を使用してシュリンクラップを加熱し、ガラス針を金属針に固定します。
その後、はさみを使用して、先端の長さを約8mmになるようにガラス針をトリミングします。針をテストするには、1 mLの注射器に26ゲージの針を取り付けて蒸留水を充填します。カスタムガラス針の注射器から金属プランジャーを取り外し、水で満たされた注射器の針をカスタムシリンジのベースに挿入します。
ガラス針と金属針の界面に漏れがないか調べ、安定した水の流れを確認します。次に、マイクロ遠心管に蒸留水を充填します。カスタムガラス針注射器を使用して、蒸留水を引きます。
針を点検して、液体が注射器に取り込まれ、泡がないことを確認します。気泡がある場合、または水が針に引き込まれていない場合は、針をトリミングすると圧力を軽減することができます。この後、慎重に手術に必要なまで、付属のガラス針で注射器をシリンジボックスに保管してください。
透過電子顕微鏡による検査は、長いフィブリルの存在を確認する。それに比べて、α-シヌクレインモノマーは目に見える大麦であり、識別可能な形状を有しない。次に、フィブリルのアナロイド確認がチオフラビンTアッセイを使用して確認されます。
代表的なアッセイは、dPBSおよびマウスモノマーがマウスPfFFsと比較して相対的な小麦粉単位で低い信号を生成することを示す。人間のPfFは同様にモノマーよりも高い信号を生成するが。
ペリチブルフィブリルの存在をアセシングするために、沈積アッセイが行われる。マウスとヒトの両方のPFFサンプルにおいて、上清よりも多くのタンパク質がペレットに含まれる必要があります。対照的に、マウスおよびヒトモノマーからのタンパク質の大部分は、ペレット中にほとんど存在しない上清に存在する。
マウスとヒトのFPFの両方が超音波処理され、αシヌクレインインを播種するための適切な長さのPfFFを生成します。約500個のフィブリルを総合的に調べると、マウスの線維の平均長さは約44ナノメートルである。60ナノメートル以下のPPFの86.6%を有する。
しかし、ヒトPfFの平均長さは約55.9ナノメートルで、Pffの69.6%は60ナノメートル以下です。PFF有効性のインビボ検査は免疫ヒストケミストリーを用いて確認される。実質的なニグラに形成された含入物は、リン酸化アルファシヌクレインを含み、アミロイド構造を含み、チオフラビンSで染色し、プロテイナーゼK消化に耐性があるという点で、レビー体と同様の特性を共有する。
超音波処理は、エアロゾル化された前形成フィブリルに個々の超音波処理を公開することができます。したがって、適切な安全服装を着用し、露出のリスクを最小限に抑えるためにフードで超音波処理を行う必要があります。
