알파-시뉴클레인 미리 형성 된 Fibril 모델은 synucleinopathies를 공부하기 위해 전 세계 실험실에서 사용되고 있습니다. 이 모델은 많은 실험실에서 성공적으로 사용되었지만 일부 그룹은 피브릴을 생성하고 일관된 알파 시뉴클레인 병리학을 생성하는 불일치를 경험했습니다. 우리는 알파 시뉴클레인 단음체에서 피브릴의 생성과 생체 내 사전 형성 된 섬유의 사용을 자세히 설명이 프로토콜이 프로토콜의 사용에 대해 연구자 가지고 질문에 대답 할 수 있기를 바랍니다.
알파-시뉴클레인 사전 형성 된 피브릴 모델은 알파 시뉴클레인 병리학 및 신경 변성과 같은 파킨슨 병의 주요 특징을 재구성합니다. 그리고 그것은 일부 동물 모델에서 겸손한 모터 장애로 이어질 것으로 나타났습니다. 인산화 된 알파-시뉴클레인과 신경 변성을 향한 연장 된 시간 과정을 포함하는 포함 된 포함의 형성은 연구원에게 synucleinopathy의 진행을 통해 다른 단계를 제공, 연구 하고 잠재적인 치료 개입에 대 한 대상.
사용자 정의 유리 바늘의 준비를 시연, 우리의 실험실 기술자입니다, 크리스토퍼 켐프. 이 절차를 시작하려면 얼음에 알파 시뉴클레인 단량체를 해동하십시오. 튜브를 부드럽게 가볍게 쓸어가서 해동된 단조로움을 다시 감쇠시켰다.
그리고 원심분리기는 15, 000g, 섭씨 4도에서 10분 동안. 이어서, 상체를 깨끗한 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브로 이송하고 전송된 양을 기록한다. 1x dPBS로 단조체를 1x dPBS로 희석하여 mL당 5 mg의 최종 농도로 희석합니다.
간략하게 소용돌이가 섞이고, 간략하게 원심분리기를 사용하여 튜브 바닥의 모든 액체를 수집합니다. 다음으로 접착제 필름을 사용하여 마이크로 원심분리기 튜브 뚜껑을 닫습니다. 튜브를 1, 000 rpm에서 흔들면서 섭씨 37도에서 7일 동안 뚜껑을 닫은 궤도 열 믹서에 넣습니다.
7 일의 끝에서, 튜브의 내용은 탁탁으로 표시해야합니다. 첫째, 장갑, 실험실 코트 및 얼굴 방패를 포함하여 필요한 모든 개인 보호 장비를 착용하십시오. 그런 다음, 세포 배양 후드에서, 컨버터에 3.2 mm 직경 프로브를 부착한다.
초음파 차단기 진폭을 30 %로 설정하고 펄스를 1 초 및 1 초 끄고 1 분으로 펄스합니다. 실온에서 피브릴을 해동하고 문화 후드에 있는 동안 멸균 dPBS로 피브릴을 희석시하십시오. 다음으로, 70%에탄올로 실험실 조직을 약화시키고 이를 사용하여 초음파 처리기의 프로브를 닦아 청소하십시오.
프로브의 끝을 이중 분수물에 담그고 10번 펄스하여 프로브를 더 청소합니다. 그 후, 실험실 조직으로 프로브건조를 닦아냅니다. 청소된 프로브 팁을 희석된 피브릴튜브에 넣고 팁을 튜브 바닥에 놓습니다.
각 펄스 동안 프로브를 위아래로 이동하면서 이전에 설정된 매개 변수를 사용하여 희석 된 피브릴을 초음파 처리하여 액체의 모든 피브릴이 초음파 처리되도록합니다. 초음파 처리 후, 튜브의 측면에서 모든 액체를 수집하는 2, 000g에서 1 초 동안 간략하게 원심 분리기. 프로브 팁을 1% SDS로 침수하고 프로브를 청소하기 위해 10번 펄스합니다.
그런 다음, SDS에서 팁을 제거하고 이중 증류수에 담근 후 10번 펄스합니다. 70%에탄올로 감쇠된 실험실 조직으로 프로브를 닦고 건조한 실험실 조직으로 말리십시오. 변환기에서 프로브를 분리하고 저장합니다.
그 후 후드의 모든 표면을 1%SDS로 닦아내고 70%에탄올이 뒤를 따릅니다. 먼저 실리콘 유리 모세관 튜브를 유리 바늘 풀러에 넣습니다. 가열 요소를 켜고 부착 된 무게가 가열 된 유리 모세관 튜브를 스트레칭 할 수 있습니다.
다음으로 가위를 사용하여 중간에 가장 얇은 지점에서 당겨진 유리 모세관 튜브를 자르고 유리 바늘 풀러에서 유리 바늘을 제거합니다. 그런 다음 가위를 사용하여 수축 랩 튜브의 길이를 약 40mm로 자른다. 수축 랩을 10 마이크로리터 의 금속 바늘 위에 밀어 주사기를 휘청거.
열을 가열하고 바늘에 수축 랩을 부착하는 열 화염을 사용, 열을 균등하게 적용하기 위해 바늘을 회전해야합니다. 끌어당겨진 유리 바늘의 큰 끝을 주사기의 금속 바늘 위에 조심스럽게 밀어 낸다. 그 후, 수축 랩 튜빙의 길이를 약 40mm로 자르고 유리 바늘 위에 조심스럽게 밀어 유리 바늘의 베이스와 주사기의 금속 바늘을 겹쳐냅니다.
금속 바늘에 유리 바늘을 고정하기 위해 수축 랩을 가열하는 불을 사용합니다. 바늘을 더욱 보호하고 잠재적 누출을 방지하기 위해 수축 랩 튜브의 추가 길이를 약 40mm로 자르고 유리 바늘과 주사기의 금속 바늘의 베이스를 겹치기 위해 유리 바늘 위로 조심스럽게 밀어 냅니다. 금속 바늘에 유리 바늘을 고정하기 위해 수축 랩을 가열하는 불을 사용합니다.
그런 다음 가위를 사용하여 유리 바늘을 다듬어 팁이 약 8mm 길도록 합니다. 바늘을 테스트하려면 1 mL 주사기를 증류수와 함께 부착 된 26 게이지 바늘로 채웁니다. 사용자 정의 유리 바늘 주사기에서 금속 플런저를 제거하고 사용자 정의 주사기의 베이스에 물 채워진 주사기의 바늘을 삽입합니다.
유리 바늘과 금속 바늘의 계면을 검사하여 누출을 검사하고 꾸준한 물 흐름을 확인합니다. 그런 다음 마이크로 원심 분리기 튜브를 증류수로 채웁니다. 사용자 정의 유리 바늘 주사기를 사용하여 증류수에 그립니다.
바늘을 검사하여 액체가 주사기로 옮겨지고 있으며 거품이 없음을 확인합니다. 거품이 있거나 물이 바늘에 그려지지 않는 경우 바늘을 트리밍하면 압력을 완화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그 후, 수술에 필요할 때까지 부착 된 유리 바늘로 주사기를 조심스럽게 보관하십시오.
전송 전자 현미경 검사로 검사는 긴 섬유의 존재를 확인합니다. 이에 비해, 알파 시뉴클레인 단량체는 보리를 볼 수 있으며 눈에 띄는 모양이 없습니다. 그런 다음 티오플라빈 T 분석체를 사용하여 피브릴의 항문 성 확인이 확인됩니다.
대표적인 분석은 dPBS와 마우스 단량체가 마우스 PFFs에 비해 상대 밀가루 분단 단위에서 하부 신호를 생성한다는 것을 보여줍니다. 인간 PFF도 마찬가지로 단량제보다 더 높은 신호를 생성합니다.
펠리탈 피브릴의 존재를 내재하기 위해 퇴적물 분석이 수행됩니다. 마우스와 인간 PFF 샘플 모두에서, 초검형 위반은 상수보다 펠릿에 더 많은 단백질을 가져야한다. 대조적으로, 마우스와 인간 단량체에서 단백질의 대다수는 펠릿에 거의 존재하는 상부체에 존재합니다.
마우스와 인간 PFF는 알파 시뉴클레인 포함을 시드하는 데 적합한 길이의 PFF를 생성하기 위해 초음파 처리됩니다. 약 500개의 피브릴을 종합적으로 검사한 결과, 마우스 피브릴의 평균 길이는 약 44나노미터입니다. PFF의 86.6%가 60나노미터 이하를 측정합니다.
그러나 인간 PFF는 평균 길이약 55.9나노미터로 PFF의 69.6%가 60나노미터 이하를 측정합니다. PFF 효능의 생체 내 검사에서 면역히스토케를 사용하여 확인된다. 실질적인 니그라에서 형성된 포함물질은 인산화된 알파 시뉴클레인을 함유하고, 아민로이드 구조를 포함하고, 티오플라빈 S를 함유하고, 단백질제 K 소화에 내성이 있다는 점에서 루이 바디와 유사한 특성을 공유한다.
초음파 처리는 에어로졸화 된 사전 형성 된 피브릴에 개별 초음파 를 노출 할 수 있습니다. 따라서 적절한 안전 복장을 착용하고 노출 위험을 최소화하기 위해 후드에서 초음파 처리를 수행해야합니다.
