タンデムでのRNA免疫沈降、シーケンシング、またはRIPiT-Seqは、RNAのどの領域が特定のRNA結合タンパク質によって結合されているかを同定するための方法である。RIPiTの最もユニークな利点は、2つの精製で2つの異なるタンパク質を標的にする能力です。これは、他の複合体とは組成的に異なるRNAタンパク質複合体を濃縮するための強力な方法を提供します。
また、RIPiT-SeqはUV架橋独立性であり、直接結合することなくRNAに作用する多くのタンパク質に適用することができます。この方法は直接的に治療や診断に向けては及びませんが、RNA結合タンパク質およびRNA処理は神経障害および癌のようないくつかの疾患に関連しています。RIPiT-Seqは、疾患に関連するRNA結合タンパク質の機能を研究するためのツールを提供します。
RIPiT-Seqはエピトープタグ付きタンパク質を発現できるシステムを必要とします。HEK293細胞でしか試験されておらず、細胞培養に最も適している。しかし、CRISPRを使用してタンパク質にタグを付ける能力を持つRIPiT-Seqは、現在の多様なシステムに適用できます。
RIPiTの成功は2つの効率的な免疫沈降に依存するため、使用されている抗体の免疫沈降条件を最適化することが重要です。また、RNAを使用するには適切な予防措置が必要であるため、RNA抽出中および後にRNaseフリー試薬を使用する必要があります。この手順をデモンストレーションすることは、私の研究室の大学院生であるローレン・ウッドワードです。
15センチメートルプレートあたり15ミリリットルの冷やされたPBSで単層細胞を穏やかに洗浄することによって開始します。その後、PBSの30ミリリットルに細胞を削り取り、50ミリリットルの円錐管に集めます。400gで400gで摂氏4度で10分間遠心して細胞をペレットにし、上清を捨てる。
氷冷低張性のリシスバッファーの4ミリリットルを追加し、細胞を再中断するためにP1000ピペットを使用しています。ライセートを5ミリリットルのチューブに移し、氷の上で10分間インキュベートします。氷浴にライセートを入れ、原稿の指示に従って超音波処理します。
その後、5モル塩化ナトリウムの108マイクロリットルを加え、塩濃度を150ミリモルに調整します。次いで、摂氏4度で10分間10分間12,000gの後にリセートを遠心し、ウェスタンブロット分析のために上清の20マイクロリットルを回収する。事前洗浄FLAGアガロースビーズ原稿の指示に従って、5ミリリットルチューブ内のビーズの750マイクロリットルに残りの上清を適用します。
FLAGアガロースビーズを細胞抽出物と共に摂氏4度で1~3時間、穏やかな混合でインキュベートします。インキュベーション後、400gで400gで4度で1分間の遠心分離によりビーズをペレット化し、ウェスタンブロット分析のために上清の20マイクロリットルを回収した。残りの上清を捨て、4ミリリットルのイソウォッシュバッファーで再懸濁してビーズを洗います。
もう一度ビーズをペレットにし、上清を取り除きます。原稿の指示に従って750マイクロリットルのISO洗浄バッファーでRNase Iを希釈し、FLAGアガロースビーズに添加します。穏やかな混合で摂氏4度で混合物をインキュベートし、遠心分離によってビーズをペレットします。
ウェスタンブロット分析のために20マイクロリットルの上清を収集し、残りを捨てます。次に、先に述べたようにイソ洗浄緩衝液でビーズを洗浄する。次に、ビーズに溶出バッファーの375マイクロリットルを加え、1〜2時間摂氏4度で穏やかに振ることによって、親和溶出を行う。
インキュベーション後、ビーズをペレット化し、ウェスタンブロット分析用の溶出の15マイクロリットルアリコートを収集する。アフィニティー溶出が進行中で、磁気ビーズ抗体の結合を行います。イソ洗浄バッファーの1ミリリットルで50マイクロリットルの磁気ビーズを洗浄することで始めます。
ビーズを100マイクロリットルの共役バッファーに再懸濁し、適切な量の抗体を添加します。次いで、ビーズを室温で少なくとも10分間インキュベートする。磁気ビーズを共役バッファーで 2 回洗浄し、375 マイクロリットルの RIPiT 希釈バッファーでビーズを再懸濁します。
ビーズを氷の上に保存し、免疫沈降するまで保存します。FLAGアフィニティー溶出を抗体結合型の磁気ビーズに適用し、摂氏4度で1〜2時間穏やかな混合でインキュベートする。マグネットでマグネットビーズを捕獲し、ウェスタンブロット分析のために15マイクロリットルの上清を集める。
その後、ビーズをイソウォッシュバッファで7回洗浄します。透明なサンプルバッファーの100マイクロリットルに磁気ビーズを再懸濁し、10分間氷上で懸濁液をインキュベートすることにより、変性溶出を進めます。インキュベーション中に、ビーズを定期的にフリックして再中断します。
マグネット上の磁気ビーズをキャプチャし、ウェスタンブロット分析のための溶出の15マイクロリットルを収集します。残りの溶出を新しい1.5ミリリットルチューブに移します。RNAを抽出するには、RNaseフリー水320マイクロリットル、フェノールクロロホルムイソアミルアルコール400マイクロリットルをRIPiT溶出に加えます。
混合物をボルテックスし、5分間12,000gで遠心分離する。水相の350マイクロリットルを別のチューブに集めます。酢酸ナトリウム、塩化マグネシウム、グリコーゲン、エタノールを採取したサンプルに加え、一晩マイナス20°Cでインキュベートします。
翌日、12,000gで摂氏4度で30分間遠心分離してRNAをペレット化し、70%エタノールで洗浄する。エタノール洗浄後、T4ポリヌクレオチドキナーゼ、またはPNKでRNAをATPなしで処理し、原稿の指示に従ってフェノールクロロホルム精製を行う。クリーンなRNAを4.5マイクロリットルのRNaseフリー水で再懸濁します。
RNAの収量を定量化するために、PNKと32P標識されたATPを原稿の方向に従ってRNAに放射標識する。サイズおよび量の標準のための低範囲DNAの梯子および20から40ヌクレオチドの合成オリゴを使用する。標識したRNAを26%の尿素ポリアクリルアミドゲルで解決します。
原稿の方向に従ってゲルを乾燥させ、適切な信号が検出されるまでゲルをホスホスクリーンに当てはめます。この手法は、エキソン接合複合体またはEJCの相互作用を調べるのに使用されています。RIPiT手順の各主要工程から精製されたタンパク質のウェスタンブロット分析は、精製EJCがEIF4A3とMAGOHの両方を含んでいることを示しています。
陰性制御HNRNPA1は、溶出中に検出されない。RNAフットプリントシグナルの強度は、RNAタンパク質相互作用の量と相関する。より強い足跡は、RNAのEJC占有率を増加させるプロマイシンで処理された細胞に対してRIPiTを行ったときに観察される。
RIPiTが有効であることを確認するには、ウェスタンブロットでIPの効率をテストすることが重要です。深いシーケンシングを進める前に、RNAの量と品質を評価することも重要です。2018年、Singhラボはこの技術を使用して、エキソン接合複合体の2つの組成的に異なるバリエーションを精製し、RNA結合パターンを同定することに成功しました。
研究者が自動ラジオグラフィーでRNAフットプリントを検出することを選択した場合、すべての適切な放射線安全手順とプロトコルに従う必要があります。
