著者は、議論や実験的な援助のためにウレ、ラスコームとジュパン研究所のすべてのメンバーに感謝。我々は、ハイスループットシーケンシングのためにジェームズハドフィールドとニックマシューズに感謝。我々はiCLIPメソッドがここにロバートダーネルの研究室でカークジェンセンとJUによって開発された株式は、オリジナルのクリップのプロトコルでいくつかの手順を、説明することを指摘したいと思います。この作品は、欧州研究評議会の助成金JUとJKに長期ヒューマンフロンティアサイエンスプログラムのフェローシップへ206726 - CLIPによってサポートされていました

1。 UV架橋組織培養の細胞<ol><li>メディアを取り出して、10cmのプレート（十分な三つの実験用）で培養した細胞を6 mlの氷冷したPBSを加える。 </li><li>氷の上に蓋と場所を削除します。 254nmで少なくとも150ミリジュール/ cm 2の一回照射する。 </li><li>セルリフターでこすることにより細胞を収集する。 </li><li> threeマイクロチューブの各々に2 mlの細胞懸濁液を移す。 4℃で10秒トップスピードでスピンは℃で、細胞をペレット化し、上清を除去します。 </li><li>スナップインの凍結-80ドライアイスとストアの細胞ペレットを° C使用時まで。 </li></ol> 2。ビーズの準備<ol><li>新鮮なマイクロチューブに実験あたり蛋白質ダイナビーズ（DYNAL、100.02）（マウスまたはヤギ抗体をプロテインGのダイナビーズを使用）100μLを加える。 </li><li>溶解バッファー（; 100mMのNaCl、1％NP - 40、0.1％SDS、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、100分の1プロテアーゼ阻害剤カクテルIII、Calbiochem社の50mM Tris - HCl、pH7.4）で2倍のビーズを洗浄する。 </li><li> 20から10μgの抗体を用いた100μlの溶解バッファーでビーズを再懸濁します。 </li><li> 30〜60分間室温でチューブを回転させる。 </li><li> 900μlの溶解緩衝液で3倍洗浄し、4.1のステップに進むために準備されるまで最後の洗浄に残す。 </li></ol> 3。細胞溶解および部分的なRNAの消化<ol><li> 1mlの溶解緩衝液と1.5 mlのマイクロチューブへの転送で細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>アーゼI（Ambion社、AM2295）の1 / 500希釈を準備します。 10μlのRNaseの私の希釈だけでなく、細胞溶解液に2μlのターボDNaseを追加（1 / 500アーゼIの希釈液[低アーゼ]ライブラリの準備のために使われ、50分の1希釈液[高アーゼ]抗体の特異性のために制御することが必要です） 。 </li><li> 1100 rpmで振盪し、37℃で正確に3分間° Cのサンプルをインキュベートする。すぐに氷に転送する。 </li><li> 4℃とライセートをクリアするには、20分間22000グラムを回転させる。慎重に（ペレットと約50μlのライセートを残す）上清を集める。 </li></ol> 4。免疫沈降<ol><li>ビーズ（ステップ2.5から）から、洗浄バッファーを除去し、細胞溶解液を（ステップ3.4から）を追加。 </li><li> 4℃で2時間のサンプルを回転℃に</li><li>上清を捨て、900μlの高塩緩衝液（50mMトリス- HCl、pH 7.4; 1MのNaCl、1mMのEDTA、1％NP - 40、0.1％SDS、0.5％デオキシコール酸ナトリウム）と2倍のビーズを洗浄する。 </li><li> 900μlの洗浄バッファー（; 10mMのMgCl 2、0.2％Tween - 20を20mMトリス- HCl、pH7.4）で2倍洗浄する。 </li></ol> 5。 RNA 3&#39;末端の脱リン酸化<ol><li>上清を捨て、20μlのPNKミックス（15μlの水、4μlの5 × PNKのpH6.5の緩衝液[350mMTris -塩酸、pH 6.5、50mMMgCl 2 25mMdithiothreitol]; 0.5μlのPNKの酵素、0.5μlのRNasin [プロメガ社製]）でビーズを再懸濁します。 </li><li> 37℃で20分間インキュベート℃に</li><li> 500μlの洗浄バッファーを追加し、高塩濃度緩衝液で1倍を洗う。 </li><li>洗浄バッファーで2倍洗浄する。 </li></ol> 6。 3&#39;末端をRNAにリンカーライゲーション<ol><li>注意深く上清を除去し、（9μlの水、20μlのライゲーションミックスでビーズを再懸濁し、4μlの4倍のライゲーションバッファー[200 mMTris -塩酸、40mのMM GCL 2、40mMのジチオスレイトール]、1μlのRNAリガーゼ[NEB];0.5μlのRNasin [プロメガ]、1.5μlのプレポリアデニル化リンカL3 [20μM];4μlのPEG400 [81170、シグマ]）。 </li><li> 16歳で一晩インキュベート℃、 </li><li> 500μlの洗浄バッファーを追加してから、1ミリリットル高塩濃度緩衝液で2倍の洗浄。 </li><li>回目の洗浄を1 mlで1 mlの洗浄バッファーで2倍とまま洗う。 </li></ol> 7。 RNAの5&#39;末端標識<ol><li>上清を除去し、ホットPNKミックス8μlでビーズを再懸濁（0.4μLPNK [NEB]; 0.8μlを32 P -γ- ATP、0.8μlの10 × PNKバッファ[NEB]、6μlの水）。 </li><li> 37℃で5分間インキュベート℃を</li><li>ホットPNKミックスを削除し、20μlの1 × Nupageのローディングバッファー（Invitrogen）中でビーズを再懸濁します。 </li><li> ℃で10分間、70℃サーモミキサーでインキュベートする。 </li><li>すぐに沈殿するために磁石の上に空のビーズを配置し（ステップ8を参照）ゲル上清をロードする。 </li></ol> 8。 SDS - PAGEおよび膜の転送<ol><li> 4-12％NuPAGE製造業者の指示に従ってビス - トリスゲル（Invitrogen社）にサンプルをロードする。緩衝液（Invitrogen）を実行して1 × MOPS 0.5リットルを使用してください。また、事前に染色されたタンパク質サイズマーカー（たとえば、このページの定規に加え、Fermentas、SM1811）の5μlをロードする。 </li><li> 180℃で50分間ゲルを実行V. </li><li>ゲルの前面を削除し、固形廃棄物（遊離放射性ATPを含む）として廃棄する。 </li><li>ゲルからメーカーの指示（Invitrogen社、30 Vで転送1時間）に応じてNOVEXウェット転写装置を用いてニトロセルロース膜にタンパク質- RNA複合体を転送する。 </li><li>転送後、PBSバッファーでメンブレンを洗い流した後、サランラップに包んで、-80 ° C（場所後のtを揃えるために膜の横の蛍光ステッカーをで富士フィルムに公開彼フィルムとメンブレン、30分、1時間と一晩のためのエクスポージャーを実行）。 </li></ol> 9。 RNA分離<ol><li>マスクとして、ステップ8.5からオートラジオグラフを用いて、低RNaseの実験から、タンパク質- RNA複合体を分離する。いくつかの小さなスライスに膜のこの部分を切り取り、1.5 mlマイクロチューブに入れます。 </li><li>膜片にし、10μlのプロテ​​イナーゼK（ロシュ、03115828001）200μlのPKバッファー（10mMのEDTA; 50mMのNaCl 100mMのトリス- HCl pH7.4）を追加します。 37℃で20分間1100 rpmで振盪しながらインキュベート℃を</li><li> PKureaバッファ（; 50mMのNaCl、10mMのEDTA、100mMトリス- HCl pH7.4の7 M尿素）200μlを加え、37℃で20分間インキュベート℃を</li><li>解決策を収集し、RNAをフェノール/クロロホルム400μlの（Ambion社、9722）2 mlの位相ロックジェルヘビーチューブ（713〜2536、VWR）にそれを一緒に加える。 </li><li> 1100 rpmで振盪し、30℃で5分間℃でインキュベートする。室温で13,000 rpmで5分間回転させて位相を区切ります。 </li><li> （ピペットでゲルに触れないよう注意してください）​​を新しいチューブに水層を移す。 0.5μlのglycoblue（Ambion社、9510）と40μlの3 M酢酸ナトリウム液（pH5.5）と混合する。その後、1ミリリットルの100％エタノールを加える、-20℃で一晩再び混合し、沈殿</li></ol> 10。逆転写<ol><li> 15000回転、4で20分間スピン℃に上清を除去し、0.5ml 80％エタノールでペレットを洗浄。 </li><li> 7.25μlのRNA /プライマーミックスでペレットを再懸濁し（6.25μlの水、0.5μlのRCLIPのプライマー[0.5pmol/μl];0.5μlのdNTPミックス[10mMの]）。各実験や複製については、個々のバーコードのシーケンスを（14を参照）を含む異なるRCLIPのプライマーを使用してください。 </li><li> 70℃で5分間インキュベート° C 25℃に冷却する前に</li><li> 2.75μlのRTミックス（;0.5μlの0.1M DTT、0.25μlを上付きIII逆転写酵素[インビトロジェン] 2μlの5 × RTバッファー）を追加します。 </li><li> ° C、42℃で20分° C、50℃40分80℃、5分間4℃℃に冷却する前に、Cは25で5分間インキュベート</li><li> 90μlのTEバッファー、0.5μlのglycoblueと10μlの酢酸ナトリウムのpHは5.5とミックスを追加。その後、250μlの100％エタノールを追加し、-20℃で一晩再び混合し、沈殿</li></ol> 11。 cDNAのゲルの浄化<ol><li>スピンダウンすると（10.1を参照）のサンプルを洗い、その後水6μlにペレットを懸濁します。 </li><li> 6μlの2 × TBE -尿素のローディングバッファー（Invitrogen社）を追加します。熱サンプルを80℃に直接ロードする前に、3分間。 </li><li>プレキャスト6パーセントTBE -尿素ゲル（Invitrogen社）にサンプルをロードし、製造業者によって説明されているように180 Vで40分間実行する。また、その後のカット​​（下記参照）のための低分子量マーカーをロードする。 </li><li> 120から200 NT（高）、85から120ヌクレオチド（培地）と70〜85ヌクレオチド（低）で3つのバンドをカット。 theupperの染料と（図3を参照）切除を導くためにプラスチック製のゲルのサポート上のマークを使用してください。そのRCLIPのプライマーおよびL3のシーケンスが一緒にCLIPのシーケンスの52 NTのアカウントを注意してください。 </li><li> 400μlのTEを追加し、1 mlのシリンジのプランジャーを使用して小片にゲルスライスを押しつぶす。 37℃2時間1,100 rpmで振盪しながらインキュベート℃に</li><li>場所コスターSpinXの列（コーニング社、8161）に2つの1 cmのガラスプレフィルター（ワットマン、1823010）。カラムにサンプルの液体部分を転送します。 1.5 mlチューブに13,000 rpmで1分間スピン。 </li><li> 0.5μlのglycoblueと40μlの酢酸ナトリウムのpHは5.5を追加してから、サンプルを混ぜる。 1ミリリットルの100％エタノールを追加し、-20℃で一晩再び混合し、沈殿</li></ol> 12。 cDNAの5&#39;末端にプライマーのライゲーション<ol><li>スピンダウンとサンプルを洗う（10.1参照）、その後、8μlのライゲーションミックスでペレットを再懸濁（6.5μlの水、0.8μlの10xのCircLigaseバッファーII、0.4μLの50mMのMnCl 2を 、0.3μL、Circligase II [EPICENTRE]）とインキュベート60℃で1時間</li><li> 30μlのオリゴアニーリング混合追加（26μlの水を、3μlのFastDigestバッファ[Fermentas];1μlのcut_oligo [10μM]）。 95℃で1分間インキュベート℃にその後、毎20秒に1ずつ温度を下げる° Cを25日まで℃に達しています。 </li><li> 2μlのBamHI部位（高速Fermentas）と37℃で30分間インキュベート℃を追加</li><li> 50μlのTEおよび0.5μlのglycoblueとミックスを追加。 10μlの酢酸ナトリウムのpHは5.5とミックスを追加してから、250μlの100％エタノールを加える。 -20℃で再び混ぜ合わせ、一晩沈殿</li></ol> 13。 PCRの増幅<ol><li>スピンダウンすると（10.1を参照）のサンプルを洗浄し、19μlの水でペレットを再懸濁します。 </li><li> （;1μlのプライマー混合P5/P3 solexa、10μMの各、20μlのAccuprimeスーパーミックス1酵素[インビトロジェン] 19μlのcDNA）をPCRミックスを調製する。 </li><li>以下のPCRのプログラム実行：25-35サイクル 、68℃で3分間、4 [30秒、94℃で15秒、65℃で30秒→68℃] 94℃2分間を、° C永遠に。 </li><li>プレキャスト6パーセントTBEゲル（Invitの2 5倍TBEローディング緩衝液の液と負荷で8μlのPCR産物を混ぜてロゲン）。 Sybrgreen I（Invitrogen社）でゲルを染色し、ゲルイメージャーで分析する。 </li><li> RCLIPのプライマーのバーコードは、ハイスループットシーケンシングのために提出する前に、多重異なるサンプルすることができます。シークエンシングのためのライブラリの15μLを提出し、残りを保存する。 </li></ol> 14。リンカーとプライマー配列プレポリアデニル3&#39;リンカーDNA： [我々は、20μMのアリコートを作成してIDTからDNAアダプターを注文して。] <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig0.jpg" alt="DNA" /> 15。代表的な結果： 膜の転送（ステップ8.5）およびPCR産物（ステップ13.4）のゲルイメージの後にタンパク質- RNA複合体のオートラジオグラフ：iCLIPライブラリの塩基配列決定に先立って、実験の成功は、2つの手順でモニターできます。低RNaseの試料のオートラジオグラフでは、びまん性放射能はタンパク質の分子量（図2、サンプル4）の上に見られるべきである。高のRNaseのサンプルの場合は、この放射能が近いタンパク質の分子量（図2、サンプル3）に焦点を当てています。は抗体が免疫沈降で使用されていない場合、シグナルは（図2、サンプル1及び2）検出されるべきである。免疫沈降の特異性のためのさらなる重要な制御には、関心14のタンパク質を発現していないUV照射または使用セルを省略する。 PCR産物（ステップ13.4）のゲルイメージは、ステップ11.4（図4、レーン4-6）で精製したcDNAの割合（高、中、低）に対応するサイズの範囲を示す必要があります。 PCRプライマーP3SolexaとP5SolexaはcDNAのサイズに追加の76 NTを導入することに注意してください。は抗体が免疫沈降中に使用されていない場合は、対応するPCR産物が（図4、レーン1-3）を検出するべきではありません。プライマーダイマーの製品は、約140 NTで表示できます。 ハイスループットシーケンシングおよびその後のバイオインフォマティクス解析の代表的な結果を得るために14を参照してください。 <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。iCLIPプロトコルの模式図。タンパク質- RNA複合体は、UV照射（ステップ1）を用いてin vivoで共有結合をクロスリンクされています。目的のタンパク質が結合したRNA（ステップ2-5）と一緒に精製される。最後放射能（ステップ6および7）ラベル付けされている逆転写の配列特異的なプライミングを可能にするため、RNAのアダプタは、5&#39;のに対し、RNAの末尾&quot;を3に連結される。架橋タンパク質- RNA複合体はSDS - PAGEおよび膜の転送（ステップ8）を使って無料のRNAから精製されています。 RNAは、プロテイナーゼKは、ヌクレオチドのクロスリンク（手順9）で、残りのポリペプチドを残してタンパク質を消化することにより膜から回収される。逆転写（RT）は、残りのポリペプチドで切り捨て二開裂可能なアダプタ領域とバーコードシーケンス（ステップ10）を紹介します。サイズの選択は、環状化する前に無料のRTプライマーを削除します。以下の線形化は、PCR増幅（ステップ11-15）に適したテンプレートを生成します。最後に、ハイスループットシーケンシングは、バーコードシーケンスがすぐに（ステップ16）cDNAの最後のヌクレオチドが続いているの読み取りを生成します。このヌクレオチド位置するので上流に架橋された塩基、結合部位の一つ上の位置は、高分解能で推定することができます。 <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig2.jpg" alt="図2" /> 図2架橋hnRNP C - RNA複合体のオートラジオグラフは、変性ゲル電気泳動およびメンブレンの転送を使用して。 hnRNP C - RNA複合体は、hnRNP C（αhnRNP C、試料3および4）に対する抗体を用いた細胞抽出物から免疫精製した。 RNAが部分的に低い（+）または高を用いて消化した（+ +）に含まれるRNaseの濃度。タンパク質のサイズ（40 kDa）をから上方にシフトする複合体は、（サンプル4）観察することができます。 RNaseの高濃度（試料3）を使用したときのシフトはあまり顕著です。は抗体が免疫沈降（サンプル1及び2）で使用されなかったときに放射性シグナルが消えます。 <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig3.jpg" alt="図3" /> iCLIP cDNA産物の切除を導くために図3。回路図を6％TBE -尿素ゲル（Invitrogen社）。ゲルは、ゲル中のcDNAおよび色素（青色光と闇）の再現可能な移行パターンにつながる180 Vで40分間実行されます。 （赤線）、高（H）、ミディアム（M）、および低（L）cDNAの分画をカットするためにカミソリの刃を使用してください。ライトブルーの染料の途中で、すぐにプラスチック製のゲルカセット上にマークが上記切断することから始めます。培地と低い分画を分割し、水色色素上記の約1cmの高い割合をトリミング。ポケットと別の車線を（この例1-4）を分離する色素によって導か垂直カットを使用してください。マーカーレーン（m）を制御するために染色し、画像化することができます切断後のサイズ。フラグメントサイズは​​、右上に表示されます。 <img src="/files/ftp_upload/2638/2638fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。ゲル電気泳動を用いてPCR増幅iCLIP cDNAライブラリーの解析。膜（図1）から回収したRNAは逆転写であり、変性ゲル電気泳動（図2）を使用してサイズを精製。 cDNAの3つのサイズ分画（高[H]：120〜200 NT、培地[M]：85から120 NTおよび低[L]：70から85ヌクレオチド）は環状、再線形化、回収してPCR -増幅した。異なるサイズ分布のPCR産物は、入力画分の異なるサイズの結果として観察することができます。 PCRのプライマーは、cDNAを、76 NTを導入しているので、大きさは中、低のサイズ分画のための146から161 NTのために高い、161〜196 ntのために196から276 NT間の範囲にしてください。は抗体が免疫沈降（レーン1-3）のために使用されていないときにPCR産物は存在しない。

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利害の衝突は宣言されません。

iCLIPプロトコルは、酵素反応と精製段階の多様な範囲を含んでいるので、それは実験が失敗する問題を識別するために、必ずしも容易ではない。同定されたRNAの相互リンクサイトの特異性をコントロールするために、一つ以上のネガティブコントロールは、完全な実験とその後の計算論throughout維持されるべきである。これらのコントロールは、非抗体サンプル、非架橋の細胞、またはノックアウト細胞や組織から免疫沈降することができます。理想的には、これらの対照実験では、任意のタンパク質- RNA複合体を浄化してはならないため、SDS - PAGEゲル上に信号を与えないこと、およびPCR増幅後には検出可能な製品があります。これらの制御ライブラリのハイスループットシーケンシングは非常にいくつかのユニークな配列を返す必要があります。結果のシーケンスはまだ少量でノックダウン細胞から精製されているのと同じタンパク質の架橋部位に対応するので、ノックダウン細胞は、シーケンシング制御としては推奨されません。 注意事項は、以前の実験からのPCR産物の混入を避けるために注意する必要があります。この問題を最小限にする最良の方法は、事前事後のPCRステップを空間的に分離することです。理想的には、PCR産物とすべての後続のステップの分析は別の部屋で実行する必要があります。また、研究室の各メンバーは、バッファや他の試薬の独自のセットを使用する必要があります。この方法では、汚染の源は簡単に識別することができます。

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Erratum: iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

ゲル電気泳動およびメンブレントランスファーのために我々は彼がX細胞SureLockの使用トン勧め®プロトコルを通じて指定されている異なるプレキャストミニゲルの使用と互換性のあるミニセルとX細胞II™ブロットモジュールキットCEマーク（Invitrogen社、EI0002）、 。使用されるすべての材料のブランドとオーダー番号は、プロトコル中に記載されています。プロトコルで使用されている酵素の一覧を下表に示します。 <table border="1"><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ＃ </td><td> コメント </td></tr><tr><td>タンパク質のDynabeadsを</td><td>インビトロジェン</td><td> 10001D </td><td>マウスまたはヤギ抗体のプロテインGを使って</td></tr><tr><td>リボヌクレアーゼI </td><td>アンビオン</td><td> AM2295 </td><td>活動は、バッチ毎に変更することができます。 </td></tr><tr><td> T4 RNAリガーゼI </td><td> NEB </td><td> M0204S </td><td> </td></tr><tr><td> PNK </td><td> NEB </td><td> M0201S </td><td> </td></tr><tr><td>プロテイナーゼK </td><td>ロッシュ</td><td> 03115828001 </td><td> </td></tr><tr><td>上付き文字III逆転写酵素</td><td>インビトロジェン</td><td> 18080044 </td><td> </td></tr><tr><td> Circligase II </td><td> EPICENTRE </td><td> CL9021K </td><td> </td></tr><tr><td> FastDigest ®をBamHI </td><td> Fermentas </td><td> FD0054 </td><td> </td></tr><tr><td> AccuPrime™スーパーミックスI </td><td>インビトロジェン</td><td> 12342010 </td><td>このPCRミックスは、私たちの手で最高の結果が得られます</td></tr></table>

iclip - transcriptome-wide mapping of protein-rna interactions with individual nucleotide resolution

転写でRNA結合タンパク質（RBPs）のユニークな組成と空間配置は、転写後調節1の多様な側面をガイド。したがって、分子レベルでの転写調節を理解することに向けた重要なステップはRBPs 2の結合部位の位置情報を得ることです。 タンパク質- RNA相互作用は、生化学的手法を用いて検討することができますが、これらのアプローチは、そのネイティブ細胞状況でのRNA結合に対処していない。ディファレンシャルディスプレイやマイクロアレイ分析（RIP -チップ）3-5と組み合わせてアフィニティー精製や免疫沈降法を採用し、携帯環境でのタンパク質- RNA複合体を研究する初期の試み。これらのアプローチは、間接的または非生理的な相互作用6を識別する傾向があった。特異性と位置分解能を向上させるためには、CLIP（UV架橋及び免疫沈降）と呼ばれる戦略は7,8を導入されました。 CLIPは、UV架橋変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を含む厳密な精製スキームとタンパク質とRNA分子のを兼ね備えています。ハイスループットシーケンシング技術と組み合わせることで、CLIPはゲノムワイドスケールでのタンパク質- RNA相互作用（HITS - CLIPまたはCLIP - seqと呼ばれる）9,10を研究する強力なツールとして証明されています。最近では、PAR - CLIPは、11,12の架橋のために光反応性リボヌクレオシド類似体を使用することを導入されました。 得られたデータの高い特異性にもかかわらず、CLIPの実験は、しばしば限られたシーケンスの複雑さのcDNAライブラリーを生成します。これは部分的に共精製されたRNAの制限された量とライブラリの準備に必要な2つの非効率的なRNAのライゲーション反応によるものです。さらに、プライマー伸長アッセイは、多くのcDNAが架橋ヌクレオチド13で途中で切り捨てることが示された。そのような切り詰められたcDNAは、標準のクリップライブラリの準備のプロトコル中に失われます。我々は最近、より効率的な分子内cDNAを環状化（図1）14で非効率的な分子間のRNAライゲーションのステップのいずれかに置き換えることによって切り捨てられたcDNAをキャプチャiCLIP（個々のヌクレオチドの解像度のCLIP）を、開発しました。重要なことは、切り捨てられたcDNAを配列決定する塩基の解像度でクロスリンク部位の位置への洞察を提供します。私たちは正常にゲノムワイドな規模でのhnRNP C粒子の組織を研究し、スプライシングの調節14にその役割を評価するiCLIPを適用する。

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iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution

転写でRNA結合蛋白質の空間配置は、転写後調節の重要な決定要因である。したがって、我々は、RNA結合タンパク質の結合部位の正確なゲノムワイドなマッピングを可能にする個々のヌクレオチドの解像度のUV架橋及び免疫沈降（iCLIP）を開発。

iCLIP - トランスクリプトーム全体の個々のヌクレオチド分解能タンパク質- RNA相互作用のマッピング

The unique composition and spatial arrangement of RNA-binding proteins (RBPs) on a transcript guide the diverse aspects of post-transcriptional ...

iclip-transcriptome-wide-mapping-protein-rna-interactions-with

Research

JoVE Journal

Biology

58.1K ビュー.  Medical Research Council - MRC. 転写でRNA結合蛋白質の空間配置は、転写後調節の重要な決定要因である。したがって、我々は、RNA結合タンパク質の結合部位の正確なゲノムワイドなマッピングを可能にする個々のヌクレオチドの解像度のUV架橋及び免疫沈降（iCLIP）を開発。

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Non-invasive 3D-Visualization with Sub-micron Resolution Using Synchrotron-X-ray-tomography

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard cuticle which makes it difficult to use protocols of classical histology. In addition, histological sectioning destroys the sample and can therefore not be used for unique material. Hence, a non-destructive method is desirable which allows to view inside small samples without the need of sectioning.
We used synchrotron X-ray tomography at the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) in Grenoble (France) to non-invasively produce 3D tomographic datasets with a pixel-resolution of 0.7&micro;m. Using volume rendering software, this allows us to reconstruct the internal organization in its natural state without the artefacts produced by histological sectioning. These date can be used for quantitative morphology, landmarks, or for the visualization of animated movies to understand the structure of hidden body parts and to follow complete organ systems or tissues through the samples.

We used synchrotron X-ray tomography at the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) to non-invasively produce 3D tomographic datasets with a pixel-resolution of 0.7&micro;m. Using volume rendering software, this allows the reconstruction of internal structures in their natural state without the artefacts produced by histological sectioning.

シンクロトロンX線トモグラフィを用いたサブミクロン分解能を持つ非侵襲的3次元可視化

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard ...

生物学

Dopamine Release at Individual Presynaptic Terminals Visualized with FFNs

The nervous system transmits signals between neurons via neurotransmitter release during synaptic vesicle fusion. To observe neurotransmitter uptake and release from individual presynaptic terminals directly, we designed fluorescent false neurotransmitters as substrates for the synaptic vesicle monoamine transporter. Using these probes to image dopamine release in the striatum, we made several observations pertinent to synaptic plasticity. We found that the fraction of synaptic vesicles releasing neurotransmitter per stimulus was dependent on the stimulus frequency. A kinetically distinct "reserve" synaptic vesicle population was not observed under these experimental conditions. A frequency-dependent heterogeneity of presynaptic terminals was revealed that was dependent in part on D2 dopamine receptors, indicating a mechanism for frequency-dependent coding of presynaptic selection.

Hui Zhang and Niko G. Gubernator contributed equally to this work.

A new means to measure neurotransmission optically using fluorescent dopamine analogs.

個々のシナプス前終末でのドーパミン放出はFFNsと可視化

The nervous system transmits signals between neurons via neurotransmitter release during synaptic vesicle fusion. To observe neurotransmitter uptake and ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR -クリップ - RNA結合タンパク質のトランスクリプトーム全体の結合部位を同定する方法

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such architectures are not random and involve interactions between gene promoters and regulatory elements 13. The binding of transcription factors to specific regulatory sequences brings about a network of transcription regulation and coordination 1, 14. 
Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) was developed to identify these higher-order chromatin structures 5,6. Cells are fixed and interacting loci are captured by covalent DNA-protein cross-links. To minimize non-specific noise and reduce complexity, as well as to increase the specificity of the chromatin interaction analysis, chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used against specific protein factors to enrich chromatin fragments of interest before proximity ligation. Ligation involving half-linkers subsequently forms covalent links between pairs of DNA fragments tethered together within individual chromatin complexes. The flanking MmeI restriction enzyme sites in the half-linkers allow extraction of paired end tag-linker-tag constructs (PETs) upon MmeI digestion. As the half-linkers are biotinylated, these PET constructs are purified using streptavidin-magnetic beads. The purified PETs are ligated with next-generation sequencing adaptors and a catalog of interacting fragments is generated via next-generation sequencers such as the Illumina Genome Analyzer. Mapping and bioinformatics analysis is then performed to identify ChIP-enriched binding sites and ChIP-enriched chromatin interactions 8. 
We have produced a video to demonstrate critical aspects of the ChIA-PET protocol, especially the preparation of ChIP as the quality of ChIP plays a major role in the outcome of a ChIA-PET library. As the protocols are very long, only the critical steps are shown in the video.

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) is a method for de novo detection of chromatin interactions, for better understanding of transcriptional control.

クロマチンの相互作用のマッピングと転写調節を理解するためのペアエンドタグシーケンシング（CHIA-PET）によるクロマチンの相互作用の解析

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to a ground-state acceptor molecule through long-range dipole-dipole interactions1. In the present sensing assay, we utilize an interesting property of PDA: blue-shift in the UV-Vis electronic absorption spectrum of PDA (Figure 1) after an analyte interacts with receptors attached to PDA2,3,4,7. This shift in the PDA absorption spectrum provides changes in the spectral overlap (J) between PDA (acceptor) and rhodamine (donor) that leads to changes in the FRET efficiency. Thus, the interactions between analyte (ligand) and receptors are detected through FRET between donor fluorophores and PDA. In particular, we show the sensing of a model protein molecule streptavidin. We also demonstrate the covalent-binding of bovine serum albumin (BSA) to the liposome surface with FRET mechanism. These interactions between the bilayer liposomes and protein molecules can be sensed in real-time. The proposed method is a general method for sensing small chemical and large biochemical molecules. Since fluorescence is intrinsically more sensitive than colorimetry, the detection limit of the assay can be in sub-nanomolar range or lower8. Further, PDA can act as a universal acceptor in FRET, which means that multiple sensors can be developed with PDA (acceptor) functionalized with donors and different receptors attached on the surface of PDA liposomes.

We demonstrate FRET between conjugated polymer polydiacetylene (PDA) and fluorophore attached to the surface of PDA liposomes for the sensing of biomolecules. PDA liposomes also contained receptor molecules on their surfaces for biomolecules to be used as probes. Ligand-receptor interactions lead to changes in the FRET efficiency between the fluorophore and PDA which is the basis of the sensing mechanism.

蛍光共鳴エネルギー移動によるリガンド - 受容体相互作用のリアルタイム監視

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Mapping the After-effects of Theta Burst Stimulation on the Human Auditory Cortex with Functional Imaging

Auditory cortex pertains to the processing of sound, which is at the basis of speech or music-related processing1. However, despite considerable recent progress, the functional properties and lateralization of the human auditory cortex are far from being fully understood. Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) is a non-invasive technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability via the application of localized magnetic field pulses, and represents a unique method of exploring plasticity and connectivity. It has only recently begun to be applied to understand auditory cortical function 2. 
An important issue in using TMS is that the physiological consequences of the stimulation are difficult to establish. Although many TMS studies make the implicit assumption that the area targeted by the coil is the area affected, this need not be the case, particularly for complex cognitive functions which depend on interactions across many brain regions 3. One solution to this problem is to combine TMS with functional Magnetic resonance imaging (fMRI). The idea here is that fMRI will provide an index of changes in brain activity associated with TMS. Thus, fMRI would give an independent means of assessing which areas are affected by TMS and how they are modulated 4. In addition, fMRI allows the assessment of functional connectivity, which represents a measure of the temporal coupling between distant regions. It can thus be useful not only to measure the net activity modulation induced by TMS in given locations, but also the degree to which the network properties are affected by TMS, via any observed changes in functional connectivity.
Different approaches exist to combine TMS and functional imaging according to the temporal order of the methods. Functional MRI can be applied before, during, after, or both before and after TMS. Recently, some studies interleaved TMS and fMRI in order to provide online mapping of the functional changes induced by TMS 5-7. However, this online combination has many technical problems, including the static artifacts resulting from the presence of the TMS coil in the scanner room, or the effects of TMS pulses on the process of MR image formation. But more importantly, the loud acoustic noise induced by TMS (increased compared with standard use because of the resonance of the scanner bore) and the increased TMS coil vibrations (caused by the strong mechanical forces due to the static magnetic field of the MR scanner) constitute a crucial problem when studying auditory processing. 
This is one reason why fMRI was carried out before and after TMS in the present study. Similar approaches have been used to target the motor cortex 8,9, premotor cortex 10, primary somatosensory cortex 11,12 and language-related areas 13, but so far no combined TMS-fMRI study has investigated the auditory cortex. The purpose of this article is to provide details concerning the protocol and considerations necessary to successfully combine these two neuroscientific tools to investigate auditory processing. 
Previously we showed that repetitive TMS (rTMS) at high and low frequencies (resp. 10 Hz and 1 Hz) applied over the auditory cortex modulated response time (RT) in a melody discrimination task 2. We also showed that RT modulation was correlated with functional connectivity in the auditory network assessed using fMRI: the higher the functional connectivity between left and right auditory cortices during task performance, the higher the facilitatory effect (i.e. decreased RT) observed with rTMS. However those findings were mainly correlational, as fMRI was performed before rTMS. Here, fMRI was carried out before and immediately after TMS to provide direct measures of the functional organization of the auditory cortex, and more specifically of the plastic reorganization of the auditory neural network occurring after the neural intervention provided by TMS. 
Combined fMRI and TMS applied over the auditory cortex should enable a better understanding of brain mechanisms of auditory processing, providing physiological information about functional effects of TMS. This knowledge could be useful for many cognitive neuroscience applications, as well as for optimizing therapeutic applications of TMS, particularly in auditory-related disorders.

Auditory processing is the basis of speech and music-related processing. Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) has been used successfully to study cognitive, sensory and motor systems but has rarely been applied to audition. Here we investigated TMS combined with functional Magnetic Resonance Imaging to understand the functional organization of auditory cortex.

機能イメージングによるヒト聴覚皮質上のシータバースト刺激の後遺症のマッピング

Auditory cortex pertains to the processing of sound, which is at the basis of speech or music-related processing1. However, despite considerable recent ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

高解像度メルト解析を用いたPCRを使用して、迅速かつ効率的なゼブラフィッシュ遺伝子型決定

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to dose-limiting toxicity and many adverse side effects. Targeting the genome with sequence-specific small molecules may enable molecules with increased therapeutic index and fewer off-target effects. N-methylpyrrole/N-methylimidazole polyamides are molecules that can be rationally designed to target specific DNA sequences with exquisite precision. And unlike most natural transcription factors, polyamides can bind to methylated and chromatinized DNA without a loss in affinity. The sequence specificity of polyamides has been extensively studied in vitro with cognate site identification (CSI) and with traditional biochemical and biophysical approaches, but the study of polyamide binding to genomic targets in cells remains elusive. Here we report a method, the crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC), that identifies polyamide binding sites across the genome. COSMIC is similar to chromatin immunoprecipitation (ChIP), but differs in two important ways: (1) a photocrosslinker is employed to enable selective, temporally-controlled capture of polyamide binding events, and (2) the biotin affinity handle is used to purify polyamide&#8211;DNA conjugates under semi-denaturing conditions to decrease DNA that is non-covalently bound. COSMIC is a general strategy that can be used to reveal the genome-wide binding events of polyamides and other genome-targeting chemotherapeutic agents.

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Identifying the direct targets of genome-targeting molecules remains a major challenge. To understand how DNA-binding molecules engage the genome, we developed a method that relies on crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC).

COSMICと細胞の薬剤-DNA相互作用のゲノムワイドなマッピング（小分子の架橋は、クロマチンを分離するために）

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is an alternative approach to chromatin immunoprecipitation (ChIP). An expressed fusion protein consisting of the protein of interest and the E. coli DNA adenine methyltransferase can methylate the adenine base in GATC motifs near the sites of protein-DNA interactions. Adenine-methylated DNA fragments can then be specifically amplified and detected. The original DamID assay detects the genomic locations of methylated DNA fragments by hybridization to DNA microarrays, which is limited by the availability of microarrays and the density of predetermined probes. In this paper, we report the detailed protocol of integrating high throughput DNA sequencing into DamID (DamID-seq). The large number of short reads generated from DamID-seq enables detecting and localizing protein-DNA interactions genome-wide with high precision and sensitivity. We have used the DamID-seq assay to study genome-nuclear lamina (NL) interactions in mammalian cells, and have noticed that DamID-seq provides a high resolution and a wide dynamic range in detecting genome-NL interactions. The DamID-seq approach enables probing NL associations within gene structures and allows comparing genome-NL interaction maps with other functional genomic data, such as ChIP-seq and RNA-seq.

We describe herein an assay by coupling DNA adenine methyltransferase identification (DamID) to high throughput sequencing (DamID-seq). This improved method provides a higher resolution and a wider dynamic range, and allows analyzing DamID-seq data in conjunction with other high throughput sequencing data such as ChIP-seq, RNA-seq, etc.

DamID-配列：アデニンメチル化DNA断片のハイスループットシークエンシングによるタンパク質-DNA相互作用のゲノムワイドなマッピング

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The development of novel pharmacological therapies to cure these patients relies on the thorough understanding of both normal physiology and pathophysiology of the SAN. Among the studies of cardiac pacemaking, the mouse SAN is widely used due to its feasibility for modifications in the expression of different genes that encode SAN ion channels or calcium handling proteins. Emerging evidence from electrophysiological and histological studies has also proved the representativeness and similarity of the mouse SAN structure and functions to larger mammals, including the presence of specialized conduction pathways from the SAN to the atrium and a complex pacemakers' hierarchy within the SAN. Recently, the technique of optical mapping has greatly facilitated the exploration and investigation of the origin of excitation and conduction within and from the mouse SAN, which in turn has extended the understanding of the SAN and benefited clinical treatments of SAN dysfunction associated diseases. In this manuscript, we have described in detail how to perform the optical mapping of the mouse SAN from the intact, Langendorff-perfused heart and from the isolated atrial preparation. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of mouse SAN physiology and pathophysiology.

Here, we present a protocol for optical mapping of electrical activity from the mouse right atrium and especially the sino-atrial node, at a high spatial and temporal resolution.