この手順の全体的な目的は、水溶性または細胞ターゲティング能力などの追加の特性を有する光ケージ化合物の調製のための実用的な方法を提供することにある。簡単な合成手順を使用して、この技術は、ケージ化合物の上に実験室を拡大し、その光過敏性を損なうことなく、追加の特性を持つケージ化合物を作るために使用することができます。この合成は、当社のクリック可能ケージ化合物がジクロロメタンやジメチルスルホキシドなどの非求核性有機溶媒に溶解した場合に光照射に安定であるように、標準的な実験室で行うことができます。
佐々木ひろげとの手順をデモンストレーションするのは、ポストドクターの鈴木明信、青木花見、渡木れ、研究室の大学院生です。30ミリリットルの丸底フラスコに709.6ミリグラムのpaBhcメタノールと397.6ミリグラムのn-カルボニルジミダゾールを加えることで始めます。フラスコに6ミリリットルのジクロロメタンを加え、周囲温度で溶液を1時間かき混ぜます。
インキュベーションの最後に、4-ジメチルアミノピリジンの342.8ミリグラムとtert-ブチル6アミノヘキシルカルバメートの552マイクロリットルを追加し、さらに3時間周囲温度で溶液をかき混ぜます。次に、真空下でロータリーエバポレーターを使用して溶媒やその他の揮発性物質を除去し、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーを使用して残渣を直接精製します。機能単位をクリック可能なケージ化合物に取り付けるには、249ミリグラムの銅2個の硫酸塩五水和物を10ミリリットルのイオン交換水に溶解し、0.1モル硫酸銅溶液を得る。
2つのプライムpaBhcモックパクリタキセルの8ミリグラムを溶解し、 7.5ミリグラムのトリス(3-ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル)アミン、162.4ミリグラムのナトリウム-l-アスコルビン酸、3.1ミリグラムの15-クロロ-3、6、9-トリオキシペンチルデシルアジドの2.5ミリリットルの混合溶媒中0.1モルリン酸緩衝液および0.5ミリリットルのスルオキシドキシメチル次に、0.1モル硫酸銅溶液の81.2マイクロリットルを反応混合物に加え、混合物を周囲温度で80分間攪拌し、HPLCによる反応の進行をモニタリングする。反応の最後に、75%のアセチルニトリル水溶液の3.5ミリリットルで沈殿物を解決し、得られた溶液を半準備HPLCシステムに直接適用して所望の製品を精製します。
量子効率測定では、UV光で覆われた蛍光灯でカバーされた蛍光灯で、10ミリリットルのKMOPSバッファーで10マイクロリットルのジメチルスルホキシドでサンプルストック溶液を希釈します。化学アクチンメーターの写真反応に使用される同じ試験管に溶液のアリコートを移す。サンプル溶液を350ナノメートル光で5秒間照射し、照射された溶液から50マイクロリットルのアリコートを定期的に取り出し、HPLCによる分析を行います。
次に、出発物質の90%が出発物質の時間依存的消失のフィッティングプロットによって反応した照射時間を秒数で決定する。クリック可能なケージ化合物のHaloTagリガンドターゲティングの場合、対象となる標的細胞集団を適切な細胞解離試薬で収穫し、DMEM濃度の1ミリリットル当たり5番目の細胞の2.5倍の10倍の細胞を再中断する。その後、37°Cと5%の二酸化炭素で一晩インキュベーションのために35ミリリットルガラス底皿に1皿あたり約10〜5番目の細胞を播種します。
翌朝、700マイクロリットルの減少した血清培地を含む1.5ミリリットルマイクロ遠心分離管内のPCDNA3種のハロー上皮成長因子受容体の血漿DNAの14マイクログラムを希釈した。次に、150マイクロリットルの減らされた血清培地に5マイクロリットルのリポエクセクション試薬を4つのチューブそれぞれに加え、チューブを周囲温度で5分間放置します。インキュベーションの終了時に、希釈したリポフィクスト試薬サンプルのそれぞれに150マイクロリットルの希釈血漿DNAを加え、さらに5分間、周囲温度でサンプルをインキュベートします。
インキュベーションの終わりに、1皿あたり2ミリリットルのPBSで細胞をすすい、各培養物に1.5ミリリットルの減らされた血清培地を加える。各皿にプラスミドリポフィケーション試薬複合体の150マイクロリットルを加え、細胞を細胞培養インキュベーターに48時間戻します。インキュベーションの終わりに、上清を吸引し、各皿に2つのマイクロモルpaBhc hex fitziハローを補充して調製したてのDMEMの1ミリリットルを加える。
30分摂氏30分後、ケージド化合物を含む培地を吸引し、PBSを1ミリリットルで2回リンスし、結合されていない化合物を除去する。各皿に500マイクロリットルの減らされた血清培地を加え、さらに30分間細胞培養インキュベーターに戻し、細胞に入った化合物を取り除いた。インキュベーションの終わりに、PBSと1皿につき1ミリリットルの細胞を2回洗い上げ、各培養物にフェノールレッドを含まない培地1ミリリットルを加えます。
次に、レーザー走査共焦点の蛍光顕微鏡法により、蛍光画像を記録します。クリック可能なケージ化合物を使用したキナーゼの局在化の写真媒介変調の場合、35ミリリットルガラス底皿あたり35ミリリットルのF12培地の2ミリリットルに約50〜5番目のTOC-A-One細胞を播種します。翌日、GFPジアシルグリセロールキナーゼγのプラスミドコーディングで細胞を48時間トランスフェクトした。
トランスフェクション終了後、トランスフェクション上清を2ミリリットルの減らされた血清培地に置き換えます。20マイクロリットルのpaBhcAA作業溶液を細胞に加え、摂氏37度と炭酸ガス5%で5~60分のインキュベーションを行います。インキュベーションの終わりに、二重光源蛍光照明器を搭載した反転蛍光顕微鏡の目的段階に皿を置きます。
実験プロトコルに従って適切な実験時点および波の長さで細胞を照射しながら、10秒ごとに細胞を10分間画像化する。この方法を用いて実証したように、パクリタキセルおよびアラキドン酸を含むいくつかの生物学的に興味深い分子のクリック可能なケージ状化合物を正常に合成することができる。水溶解性および細胞ターゲティング能力などの追加特性は、銅1触媒されたサイクリゼーションクリック反応を介してpaBhcモックパクリタキセルに導入することができる。
これらのクリック可能なケージパクリタキセルは、350ナノメートルでの照射時に親化合物を生成するために光分解することができます。クリック可能なケージ化合物の物理的および光化学的特性を表に要約します。生細胞実験では、paBhcヘックスフィッツィハローを、ハロタグタンパク質および表皮成長因子受容体を一過性に発現する培養哺乳類細胞に標的化し、細胞膜上の蛍光部分PAHBHCヘックスフィッツィハローから緑色の蛍光シグナルを誘導する。
また、GFPジアシルグリセロールキナーゼγをアラキドン酸で一過性発現するCHO-K1細胞の処理は、ジアシルグリセロールキナーゼγの細胞内局在化の調節を引き起こす。ジアシルグリセロールキナーゼγ局在における同様の変化は、UV光曝露後のpaBhc-AA処理細胞においても観察される。培養培地を増やす水溶液でのケージ実験を行う場合は、常に短波長のキャップフィルターを有する蛍光灯下で動作するようにしてください。
この手順に従って、水の溶解性、膜透過性または細胞ターゲティング能力の欠如のために生物学的実験に使用するために豊富に存在しているケージ化合物を研究することができます。
