이 절차의 전반적인 목표는 수용성 또는 세포 표적화 능력과 같은 추가 특성을 가진 광케이지 화합물의 제조를 위한 실용적인 방법을 제공하는 것입니다. 간단한 합성 절차를 사용하여,이 기술은 케이지 화합물을 통해 실험실을 확장하고 자신의 감광성을 손상시키지 않고 추가 특성으로 케이지 화합물을 만드는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 합성은 우리의 클릭 가능한 케이지 화합물이 디클로로메탄 또는 디메틸 설프리산화물과 같은 비뉴클레오필유기 용매에 용해될 때 사진 조사에 안정적이기 때문에 표준 실험실에서 수행될 수 있다.
사사키 히로나와 함께 절차를 시연하는 것은 실험실에서 졸업생인 아오키 하나미와 와타히키 레이노부 스즈키 아키노부입니다. 709.6 밀리그램의 paBhc 메탄올과 397.6 밀리그램의 n-carbonyldiimidazole을 30 밀리리터 라운드 바닥 플라스크에 첨가하여 시작하십시오. 플라스크에 건조 6 밀리리터디클로로메탄을 넣고 1시간 동안 주변 온도에서 용액을 저어줍니다.
인큐베이션이 끝나면 342.8 밀리그램의 4-디메틸아미노피리딘과 552마이크로리터의 테르부틸 6-아미노 헥실 카바메이트를 넣고 3시간 동안 주변 온도에서 용액을 저어줍니다. 그런 다음 진공 하에서 회전 증발기를 사용하여 용매 및 기타 휘발성 물질을 제거하고 실리카 젤 플래시 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 잔류물을 직접 정화합니다. 딸깍 잘 수 있는 케이지 화합물에 기능성 장치를 설치하려면 구리 2개의 황산펜타하이드레이트 249밀리그램을 이온 교환 수의 10밀리리터에 녹여 0.1 어금니 구리 황산염 용액을 제공합니다.
두 개의 프라임 paBhc 모의 파클리 탁셀의 8 밀리 그램을 용해, 트리의 7.5 밀리그램 (3-하이드록시 프로필트리아졸리아졸리멜메틸)amine, 162.4 밀리그램의 나트륨-l-아스코르바테, 15-클로로-3, 6, 9-트리옥시펜틸데실 아지드의 혼합 용매에서 0.1 어금강 완충제 및 0.5 밀리리터의 디메틸 산화물. 다음으로, 반응 혼합물에 0.1 개의 어금니 구리 황산염 용액의 81.2 마이크로 리터를 추가하고 HPLC와의 반응의 진행 상황을 모니터링하면서 80 분 동안 주변 온도에서 혼합물을 저어줍니다. 반응의 끝에서, 75%의 아세틸 니트리에 수액의 3.5 밀리리터로 침전물을 해결하고 원하는 제품을 정화하기 위해 반 전가HPLC 시스템에 직접 결과 용액을 적용한다.
양자 효율 측정을 위해 UV 광 차단 필터로 덮인 형광 램프 아래에서 10 밀리리터의 KMOPS 버퍼로 디메틸 설산화물 10 마이크로리터로 샘플 스톡 솔루션을 희석하십시오. 화학 작용계의 사진 반응에 사용되는 동일한 시험관으로 용액의 알리쿼트전달. 350나노미터 광을 5초 동안 350나노미터 광으로 시료 용액을 조사하여 HPLC의 분석을 위해 주기적으로 조사된 용액에서 50개의 마이크로리터 알리쿼트를 제거합니다.
그런 다음 시작 재료의 90 %가 시작 재료의 시간 의존적 실종의 피팅 플롯에 의해 반응되는 초에서 조사 시간을 결정합니다. 할로택 리간드의 경우, 적절한 세포 해리 시약으로 관심있는 대상 세포 집단을 수확하고 DMEM 농도의 밀리리터 당 5 세포당 2.5 배 10에서 세포를 다시 중단하십시오. 그런 다음 접시 당 5 세포당 약 10에서 35 밀리리터 유리 바닥 접시에 넣고 섭씨 37도및 이산화탄소 5%에서 하룻밤 동안 배양합니다.
다음 날 아침, PC DNA 3개의 후광 표피 성장 인자 수용체 혈장 DNA의 14 마이크로그램을 감소혈청 배지 700마이크로리터를 포함하는 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 희석시켰다. 다음으로, 4개의 튜브각각에 감소된 혈청 배지의 150 마이크로리터에 리포페션 시약의 5마이크로리터를 추가하고 튜브가 5분 동안 주변 온도에서 서있을 수 있도록 합니다. 인큐베이션의 끝에서, 희석 된 리포션 시약 샘플 각각에 희석 된 플라즈마 DNA 150 마이크로 리터를 추가하고 추가 5 분 동안 주변 온도에서 샘플을 배양한다.
인큐베이션이 끝나면 접시당 PBS 2밀리리터로 세포를 헹구고 각 배양에 1.5 밀리리터의 감소된 혈청 배지를 추가합니다. 플라스미드 지방 흡입 시약 리젠리 컴플렉스의 150 마이크로리터를 각 접시에 넣고 세포를 세포 배양 인큐베이터로 48시간 동안 되돌려 보입니다. 인큐베이션의 끝에서, 슈퍼 나티퍼를 흡인하고 각 접시에 두 개의 마이크로 몰러 paBhc 헥스 피치 후광으로 보충 갓 준비 DMEM의 1 밀리리터를 추가합니다.
섭씨 37도에서 30분 후, 케이지 화합물을 함유한 배지를 흡인하고 PBS 1밀리리터로 세포를 두 번 헹구어 언바운드 화합물을 제거합니다. 각 접시에 500개의 혈청 배지를 추가하고 세포를 세포배양배양인큐베이터로 돌려 보내 세포에 들어간 화합물을 제거합니다. 인큐베이션이 끝나면 PBS 1밀리리터와 접시당 1밀리리터로 세포를 두 번 헹구고 각 배양에 페놀 레드 없이 1밀리리터의 배지를 추가합니다.
그런 다음 레이저 스캐닝 공초점 현미경 검사법에 의해 꽃집 이미지를 기록합니다. 클릭 가능한 케이지 화합물을 사용하여 키나아제 국산화의 사진 매개 변조의 경우, 35 밀리리터 유리 바닥 접시당 햄의 F12 배지 2밀리리터에서 5번째 TOC-A-1 세포에 약 5회 10회 시드를 드시면 됩니다. 다음 날, GFP 디아실리세롤 키나제 감마에 대한 플라스미드 코딩을 통해 세포를 48시간 동안 방금 시연하였다.
경질이 끝난 후, 경피 성 수퍼네티를 감소된 혈청 배지의 2밀리리터로 교체하십시오. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 5~60분 동안 세포에 100배 의 마이크로리터 20편을 추가합니다. 인큐베이션의 끝에서, 이중 광원 형광 조명이 장착 된 반전 형광 현미경의 객관적인 단계에 접시를 놓습니다.
실험 프로토콜에 따라 적절한 실험 시점 및 파 길이에서 세포를 조사하면서 10분마다 세포를 10초마다 이미지화합니다. 입증 된 바와 같이이 방법을 사용하여, 파클리 탁셀과 아라키돈산을 포함한 일부 생물학적으로 흥미로운 분자의 클릭 가능한 케이지 화합물은 성공적으로 합성 될 수있다. 물 용해도 및 세포 표적화 능력과 같은 추가 특성은 구리 1촉매 사이클화 클릭 반응을 통해 paBhc 모의 파클리탁셀에 도입될 수 있다.
이러한 클릭 가능한 케이지 파클리탁셀은 350 나노미터에서 조사시 부모 화합물을 생성하기 위해 사진을 촬영할 수 있습니다. 클릭 가능한 케이지 화합물의 물리적 및 광화학적 특성은 표에 요약됩니다. 살아있는 세포 실험에서, paBhc 헥스 피치 후광을 배양된 포유류 세포로 표적화하여 HaloTagged 단백질과 표피 성장 인자 수용체를 일시적으로 발현하여 세포막에 형광푸스 PAHBHC 헥스 피치 후광으로부터 녹색 플로레시엔션 신호를 유도한다.
또한, 아라키돈산을 가진 GFP 디아실 글리세롤 키나제 감마를 과도하게 발현하는 CHO-K1 세포의 치료는 디아실 글리세롤 키나제 감마의 세포외 국소화의 변조를 일으킨다. 디아실 글리세롤 키나제 감마 국소화의 유사한 변화는 또한 UV 광 노출 후 paBhc-AA 처리 된 세포에서 관찰된다. 배양 배지를 증가시키는 수성 솔루션에서 caging 실험을 수행할 때는 항상 단파 길이 캡 필터가 있는 형광램프 아래에서 작업해야 합니다.
이 절차에 따라, 당신은 때문에 수용성, 막 투과성 또는 세포 타겟팅 능력의 부족으로 생물학적 실험에 사용하기 위해 풍부한 케이지 화합물을 연구 할 수 있습니다.
