O objetivo geral deste procedimento é fornecer um método prático para a preparação de compostos fotocagados com propriedades adicionais, como solubilidade da água ou capacidade de segmentação celular. Usando um procedimento sintético simples, esta técnica pode ser usada para expandir o laboratório sobre compostos enjaulados e para fazer compostos enjaulados com propriedades adicionais sem comprometer sua fotosensibilidade. Esta síntese pode ser realizada em um laboratório padrão, pois nossos compostos enjaulados clicáveis são estáveis à foto-irradiação quando dissolvidos em solventes orgânicos não nucleofílicos, como diclorometano ou sulfoxida de dimetil.
Demonstrando o procedimento com Hirona Sasaki estarão Akinobu Suzuki, um pós-doutor, Hanami Aoki e Rei Watahiki, estudantes de pós-graduação do laboratório. Comece adicionando 709,6 miligramas de metanol paBhc e 397,6 miligramas de n-carbonyldiimidazole em um frasco de fundo redondo de 30 mililitros. Adicione seis mililitros secos de diclorometano ao frasco e mexa a solução à temperatura ambiente por uma hora.
No final da incubação, adicione 342,8 miligramas de 4-Dimethylaminopyridina e 552 microliters de tert-butil seis-amino hexyl carbamate, e mexa a solução em temperatura ambiente por mais três horas. Em seguida, use um evaporador rotativo sob vácuo para remover o solvente e outros materiais voláteis, e use cromatografia de coluna flash de gel de sílica para purificar o resíduo diretamente. Para instalar uma unidade funcional no composto da gaiola clicável, dissolva 249 miligramas de cobre dois pentahidratos de sulfato em 10 mililitros de água trocada por íons para dar uma solução de sulfato de cobre molar 0,1.
Dissolver oito miligramas de dois paclitaxel mock paBhc prime, 7,5 miligramas de tris (3-hidroxipropyltriazolylme)amine, 162,4 miligramas de sódio-l-ascorbate, e 3,1 miligramas de 15-cloro-3, 6, 9-trioxypentildecil azide em um solvente misto de 2,5 mililitros de 0,1 tampão de fosfato molar e 0,5 mililitros de sulfóxido de dimetil. Em seguida, adicione 81,2 microliters de solução de sulfato de cobre molar 0.1 à mistura de reação e mexa a mistura à temperatura ambiente por 80 minutos, monitorando o progresso da reação com HPLC. No final da reação, resolva os precipitantes com 3,5 mililitros de uma solução de água de nitríl de acetil de 75% e aplique a solução resultante diretamente ao sistema HPLC semi-preparatório para purificar o produto desejado.
Para medições de eficiência quântica, sob lâmpadas fluorescentes cobertas com filtro de corte de luz UV, diluir a solução de estoque de amostra em 10 microliters de sulfóxido de dimetila com 10 mililitros de tampão KMOPS. Transfira uma alíquota da solução para o mesmo tubo de ensaio usado na reação fotográfica do actinômetro químico. Irradie a solução amostral com luz de 350 nanômetros por cinco segundos, removendo 50 alíquotas de microliter da solução irradiada periodicamente para análise do HPLC.
Em seguida, determine o tempo de irradiação em segundos em que 90% do material inicial reagiu apropriadamente parcelas do desaparecimento dependente do tempo do material inicial. Para o alvo de ligadura HaloTag de um composto enjaulado clicável, colde a população celular-alvo de interesse com um reagente de dissociação celular apropriada e suspenda as células em 2,5 vezes 10 para as quintas células por mililitro de concentração de DMEM. Em seguida, semente aproximadamente 10 a quinta células por prato em pratos de fundo de vidro de 35 mililitros para uma incubação durante a noite a 37 graus celsius e 5% de dióxido de carbono.
Na manhã seguinte, diluir 14 microgramas do DNA do PC três halo epidérmico fator de crescimento receptor plasma DNA plasmá-lo em um tubo micro centrífugo de 1,5 mililitro contendo 700 microliters de meio soro reduzido. Em seguida, adicione cinco microliters do reagente de lipofecção em 150 microliters de meio soro reduzido para cada um dos quatro tubos e deixe os tubos ficarem em temperatura ambiente por cinco minutos. No final da incubação, adicione 150 microliters de DNA de plasma diluído a cada uma das amostras de reagente de lipofecção diluída e incubar as amostras à temperatura ambiente por mais cinco minutos.
Ao final da incubação, enxágue as células com dois mililitros de PBS por prato e adicione 1,5 mililitros de meio soro reduzido a cada cultura. Adicione 150 microliters do complexo de reagentes lipofectivos plasmídeos a cada prato e devolva as células à incubadora de cultura celular por 48 horas. No final da incubação, aspire os supernacantes e adicione um mililitro de DMEM recém-preparado complementado com dois micromolar paBhc hex fitzi halo para cada prato.
Após 30 minutos a 37 graus celsius, aspire o meio contendo o composto enjaulado e enxágue as células duas vezes com um mililitro de PBS mais para remover quaisquer compostos não ligados. Adicione 500 microliters de meio soro reduzido a cada prato e devolva as células à incubadora de cultura celular por mais 30 minutos para remover os compostos que entraram nas células. No final da incubação, enxágue as células duas vezes com um mililitro de PBS mais por prato e adicione um mililitro de médio sem fenol vermelho a cada cultura.
Em seguida, registosas de floresnce por meio da microscopia de florescóptero confocal a laser. Para modulação foto-mediada da localização da quinase usando um composto enjaulado clicável, semente aproximadamente cinco vezes 10 para a quinta célula TOC-A-um em dois mililitros de Ham's F12 médio por 35 mililitros de vidro prato inferior. No dia seguinte, transfemine as células com a codificação plasmida para GFP diacylglycerol quinase gamma por 48 horas como apenas demonstrado.
Após o término da transfecção, substitua o supernatante de transfecção por dois mililitros de meio soro reduzido. Adicione 20 microliters de 100 vezes paBhcAA solução de trabalho às células para uma incubação de cinco a 60 minutos a 37 graus celsius e 5% de dióxido de carbono. No final da incubação, coloque o prato na etapa objetiva de um microscópio fluorescente invertido equipado com um iluminador de fluorescência de fonte de luz dupla.
Imagem as células a cada 10 segundos durante 10 minutos enquanto irradia as células nos pontos de tempo experimentais apropriados e comprimentos de onda de acordo com o protocolo experimental. Usando este método como demonstrado, compostos enjaulados clicáveis de algumas moléculas biologicamente interessantes, incluindo paclitaxel e ácido aracidonico, podem ser sintetizados com sucesso. Propriedades adicionais, como a solubilidade da água e a capacidade de segmentação celular podem ser introduzidas no paclitaxel mock paBhc através da reação de clique de ciclização catalisada de cobre.
Estes paclitaxels enjaulados clicáveis podem então ser fotolysed para produzir seus compostos-mãe após a irradiação a 350 nanômetros. As propriedades físicas e fotoquímicas dos compostos enjaulados clicáveis são resumidas na tabela. Em experimentos de células vivas, o alvo do auréola paBhc hex fitzi para células de mamíferos cultivadas transitenariamente expressando uma proteína HaloTagged e receptor de fator de crescimento epidérmico induz um sinal de floresnce verde do fluoresceína moiety PAHBHC hex fitzi halo na membrana celular.
Além disso, o tratamento de células CHO-K1 que expressam transitóriamente gcyl gliceol quinase glicerol glicera com ácido aracidonico causa modulação da localização subcelular do glicerol glicerol diacyl glicease gamma. Alterações semelhantes na localização de gama glicerol glicerol diacyl também são observadas em células tratadas paBhc-AA após a exposição à luz UV. Ao realizar os experimentos de caging em soluções aquosas aumentando o meio de cultura, certifique-se de sempre trabalhar sob lâmpada fluorescente com filtro de comprimento de onda curta tampado.
Após este procedimento, você pode estudar compostos enjaulados que foram abundantes para uso em experimentos biológicos devido à falta de solubilidade da água, permeabilidade da membrana ou capacidade de segmentação celular.
