このプロトコルは、細胞外小胞の良好な分離とEBDFタンパク質の高い数の通知を保証することを可能にします。他の分離手法と比較して、この手法は、より整合性と垂直アクティビティであることを維持します。EVは、LCや病理学的状態でますます研究されています。
この方法は、我々は、EVを特徴付け、研究することを選択した任意のシステムに適用することができます。その内容や生物倫理のためには、培養結果として以下の実験を行うため、EVを反復処理する際には特別な注意が必要である。視覚的なデモンストレーションは、自家製サイズ排除クロマトグラフィーカラムなどの特定の機器をホストし、ナノ粒子カウンターと質量分析計の関与をホストするために重要です。
手順を実証するのに役立つのは、研究室のアントネッラ・ラッフォ・ロメロです。細胞外小胞(EV)を条件培地から事前に単離することから始めます。ミクログリアまたはマクロファージ培養物から培養液に条件を移し、1,200回Gで遠心分離して細胞をペレット化する。
上清を新しい円錐形の管に移し、さらに20分間遠心分離機を取り込んで、アポトーシスの体を取り除きます。その後、上清を10.4ミリリットルのポリカーボネートチューブに移します。チューブを70.1 TIローターに入れ、超遠心分離機を100,000倍のGで100,000倍に置き、摂氏4度で90分間、EVをペレットします。
遠心分離後、上清を捨て、0.2マイクロメートルの濾過PBSの200マイクロリットルでペレットを再懸濁します。EVを分離するには、ガラスクロマトグラフィーカラムを洗浄して殺菌し、底部に60マイクロリットルのフィルターを置くことによって、自家製サイズ除外クロマトグラフィーカラムを準備します。架橋されたアガロースゲルろ過ベースマトリックスを使用してカラムを積み重ね、直径0.6センチメートル、高さ20センチメートルの静止相を作成します。
その後、0.2マイクロメートルの濾過PBSの50ミリリットルで位相をすすいだ。必要に応じて、後で使用するために、4°Cでカラムを保管してください。再懸濁したEVペレットを定常相の上に置き、250マイクロリットルの連続分を20個収集し、静止期の上部にPBSを追加し続けます。
分数はマイナス20°Cで保存できます。ナノ粒子追跡解析を実行するには、0.2マイクロメートルのろ過PBSと渦を用いて各画分を希釈して凝集体を排除します。溶液を1ミリリットルのシリンジに入れ、自動シリンジポンプに入れます。
次に、適切な画面ゲインレベルとカメラレベルにカメラ設定を調整し、[実行]をクリックします。15秒間1000の注入率で分析チャンバにサンプルをロードします。次に、ビデオ録画の速度流量を15秒間25回の注入速度に減少させ、安定化させます。
パーティクル フローの連続 60 秒のビデオをキャプチャします。次に、ビデオ分析の前にカメラレベルと検出しきい値を調整します。[設定 OK] をクリックして解析を開始し、完了したら [エクスポート] をクリックします。
各画分の間に0.2マイクロメートルの濾過されたPBSの1ミリリットルでシステムを洗います。電子顕微鏡分析を行う場合は、50キロダルトン遠心フィルターを使用して、対象のサイズ排除クロマトグラフィー分を濃縮します。タンパク質抽出のために、50マイクロリットルのRIPAバッファーをEVサンプルと5分間氷上で混合します。
500ワットで3回、5秒間20キロヘルツでサンプルを超音波処理します。その後、摂氏4度で10分間Gの20,000倍の遠心分離機でベシカルデブリを取り除きます。タンパク質を単離した後、12%ポリアクリルゲルの積層ゲルでタンパク質遊離を行う。
ゲル中のタンパク質をクーマシーブルーと室温で20分間混ぜます。その後、各着色されたゲル片を物品化し、小片にカットします。原稿に記載されているように、連続した一連のワッシュを通してゲル片を入れてください。
その後、真空濃縮器でそれらを完全に乾燥させます。乾燥後、10ミリモルジチオトライトールを含む100ミリモル重炭酸アンモニウム100マイクロリットルで56°Cで1時間タンパク質還元を行います。次に、50ミリモルのヨウドアセトアミドを含む100ミリモル重炭酸アンモニウム100マイクロリットルのタンパク質アルキル化を、暗闇の中で45分間行う。
原稿の方向に従ってゲル片を洗い、真空濃縮器で完全に乾燥させます。摂氏37度で20ミリモル重炭酸アンモニウムに50マイクロリットルのトリプシンを用いてタンパク質消化を行う。翌日、100%ACNの50マイクロリットルを摂氏37度で30分間、室温で15分間連続攪拌してゲルから消化したタンパク質を抽出します。
その後、20ミリモル炭酸アンモニウムで5%TFAの50マイクロリットルでタンパク質を2回抽出し、20分間連続的に攪拌します。ACNを100マイクロリットル加え、10分間撹拌を続けます。その後、タンパク質を乾燥させ、0.1%TFAの20マイクロリットルで再懸濁します。
ペプチドを脱塩および濃縮するためのC 18逆相培地を用いて10マイクロリットルピペットチップを使用してサンプルを脱塩する。その後、ACNと0.1%のギ酸でそれらを溶かします。真空濃縮器でサンプルを完全に乾燥し、液体クロマトグラフィータンデム質量分析(LC-MS)の場合は、ACN 20マイクロリットルと0.1%のギ酸で再懸濁します。
消化されたペプチドを器具にロードし、サンプル分析を行います。EV単離を確認するために、各SCC画分をナノ粒子追跡解析を行った。粒子数は、分数5、6、および7で有意に高かった。
これらの画分を1つのサンプル2F-EV陽性にプールし、かつ、1F-EV陰性および3F-EV陰性のEV負の分数と比較して、ウェスタンブロット分析を用いた。結果は、EV陽性試料および細胞ライセート制御におけるヒートショックタンパク質90の存在を示した。EV陽性試料の電子顕微鏡は、約100ナノメートルおよび400ナノメートルのサイズ範囲のEVを示した。
EV陰性サンプル中の汚染物質タンパク質を同定し、EVのタンパク質内容物を特徴付けるためにプロテオミクス分析を行った。同定されたタンパク質を、1F-EV陰性サンプルと2F-EV陽性サンプルの間、ならびに2F-EV陽性サンプルと3F-EV陰性サンプルとの間で比較した。この非標的法を用いて、536個のタンパク質のプールをExoCartaデータベースに提出し、86個のEV関連タンパク質の同定につながった。
さらに、このプールは、タンパク質相互作用およびそれらの関連する生物学的機能の同定も可能にした。EV陽性サンプルからのタンパク質が免疫および神経保護経路において役割を果たしていることが分かった。ミクログリア由来のEVの効果を、PC12細胞およびラット一次ニューロンを用いた神経突起伸長に対する評価を行った。
制御と比較してEVの下で有意な成長増加が観察された。マクロファージ由来のEVは、グリオーマ細胞浸潤について評価した。EVは、神経膠腫の成長と侵入を損なうことがわかった。
覚えておくべきことは、この手順でEVの損失を防ぐために、超遠心化ステップの上清を実際に慎重に捨ててください。私たちは、タンパク質含有量全体とEVの垂直効果に焦点を当てるために、大規模で非標的化されたアプローチを好みます。したがって、核酸中の内容物は分析を使用して関連付けることができます。
この一次培養によるアプローチにより、多様でないEVタンパク質と遊離タンパク質を区別することができます。だから、この凝固が実際のものなのか、それともむしろ他の現実なのかという疑問が残る
