現在のプロトコルは、網膜変性に対する細胞治療アプローチの開発を目指して、大型動物モデルにおける網膜オルガノイド全体の網膜下送達を詳細に示しています。この技術の主な利点は、オルガノイドを標的組織である網膜に直接送達できることです。この技術は、加齢黄斑変性症、網膜色素変性症、レーバー先天性無気力症などの進行した盲検性網膜変性状態の治療を目的としています。
手順を実演するのはピーターソン・ジョーンズ博士です。オルガノイドの網膜下移植では、スティーブンス腱切開術はさみを使用して、生後4か月の絶食麻酔をかけた猫に0.5〜1センチメートルの外側カントトミーを行い、適切なサイズのBarraquerまぶたの検鏡を切開部に配置してまぶたを開いたままにします手術助手は、手順全体を通して定期的に角膜をBSSで洗浄します。0.5カストロビエホ角膜結束鉗子と小さな蚊の止血剤を使用して、辺縁部の横にある球結膜をそっとつかみます。
2つの6-0シルク縫合糸を4時位置と8時位置の縁のすぐ隣の結膜に配置して、目を主視線で保持し、3番目のまぶたを引っ込めます。縫合糸の端を小さな蚊の止血剤で固定して操作を助け、目を貫通しないように注意しながら、部分的に縁の厚さを通して縁部の12時の位置に別の縫合糸を置きます。縫合糸をゆるく結び、端を短く切り、4時の位置で縁のすぐ隣の結膜にステー縫合糸を置き、目と主視線を保持します。
10時から2時の間に球結膜を反射し、腱切開はさみを使用して結膜を縁から2〜3ミリメートル切開します。結膜を弱体化させ、テノンのカプセルを取り除き、辺縁部から3〜5ミリメートルの2時と10時の硝子体切除ポートサイトの強膜を露出させます。キャリパーを使用して強膜切開の部位を特定し、猫で目立つ可能性のある主要な強膜血管を避けます。
右利きの外科医のために10時の器具ポートに3ミリメートルの領域を計画し、提案された硬化切開部位で結ばずに6-0または7-0ポリグラクチン十字靭帯パターン縫合糸を事前に配置します。縫合糸が所定の位置に配置されたら、助手に12時のステー縫合糸をつかんでグローブを所定の位置に保ち、0.12ミリメートルのカストロビエホ鉗子を使用して硬化性部位の横にある組織を保持します。トロカールを使用して、レンズとの接触を避けるために視神経に向かって角度を付けた2時位置と10時位置の両方で強膜を通して23ゲージの硝子体切除ポートを導入し、結束鉗子を使用して灌漑ポートをそっと押して、先端を硝子体内で視覚化できるかどうかを判断します。
アシスタントにMachemer拡大洗浄硝子体切除レンズを角膜に配置して目の後部を視覚化できるようにし、23ゲージの硝子体切除プローブカッターを機器ポートに通して部分的なコア硝子体切除術を実行してもらいます。次に、1ミリリットルのトリアムシノロン溶液を含む1ミリリットルのシリンジの針を計器ポートに導入し、250〜500マイクロリットルの結晶懸濁液を注入します。溶液が送達されたら、硝子体切除プローブを器具ポートに通し、ポートを網膜表面とは反対側に向けて視神経乳頭に近づけます。
高真空を使用して硝子体の顔を網膜から外し、インジェクターを器具ポートから網膜表面に向かって挿入し、カニューレの先端を押し出します。網膜表面の先端をそっと押し、アシスタントにシリンジプランジャーをわずかにすばやく押して網膜剥離を開始し、注入圧力を下げて、目的のサイズが達成されるまで網膜剥離をゆっくりと増加させます。インジェクターの41ゲージのカニューレを使用して、網膜はさみを導入できるようになるまで剥離をわずかに拡大し、10時の強膜ポートを取り外します。
次に、視神経に向けられたまっすぐな2.850ミリメートルのスリットナイフを使用して、レンズに触れないようにして、この部位の硬化性切開術を拡大します。移植領域に由来する網膜神経線維の損傷を避けるために視神経から離れたブレブの網膜切開を行い、出血のリスクを減らすために主要な網膜血管を切断しないようにします。オルガノイドを移植するには、拡大した強膜切開術を通してオルガノイドを搭載したガラス毛細管を網膜切開部位に向けて挿入し、毛細血管の先端を使用して網膜切開術をわずかに開き、網膜下ブレブ開口部にアクセスできるようにします。
アシスタントにインジェクターのプランジャーをもう一度ゆっくりと押してもらい、オルガノイドを網膜下ブレブに注入します。.BSSはオルガノイド、臓器を進め、網膜切開術を開いて洗い流す必要があります。すべてのオルガノイドが送達されたら、ガラス毛細管を数秒間そのままにしてから、毛細血管を目からゆっくりと取り除き、液体が突然放出されないように注意します。
毛細血管が取り外されたら、十字靭帯パターンで事前に配置された縫合糸を使用して強膜切開を閉じます。助手に輸口を取り外してもらい、強膜切開縫合糸をすばやく結び、ポリグラクチン縫合糸で腹膜を簡単な連続パターンで閉じます。6-0ポリグラクチン縫合糸と8の字型皮膚縫合糸で外側カントミーを閉じて外側眼窩を行い、単純な中断された皮膚縫合を使用して残りの傷を閉じます。
次に、適切な術後ステロイドと抗生物質カクテルを投与します。ヒト多能性幹細胞由来網膜オルガノイド負荷は、注射装置のガラスカニューレ内および手術中に直接可視化して確認することができる。網膜下腔内のオルガノイドの存在は、眼科検査と眼底画像検査によって術後に確認できます。
安楽死の前に、共焦点走査レーザー検眼鏡法およびスペクトルドメイン光干渉断層撮影イメージングを実行して、オルガノイドの位置を評価することもできます。これらの技術は、神経網膜とレシピエント眼の網膜色素上皮との間の網膜下空間における網膜オルガノイドの持続性を実証するために使用することができる。組織学的および免疫組織化学的分析を使用して、免疫抑制動物の大きな眼の網膜下腔内の異種グラフの生存を説明することができます。
訓練を受けた獣医眼科医や硝子体網膜外科医など、硝子体網膜手術の熟練した人だけがこの手順を実施する必要があります。このビデオで紹介されている技術は、硝子体網膜手術技術を診療所に翻訳するために使用される他の大型動物モデルに適用できるはずです。
