この方法は、聴覚とバランスの分野での基本的な質問に答えることができます。それは、感覚性毛細胞機能の2つの重要な側面、メカノトランスダクションおよびシナプス前活性を検出する方法を説明する。この技術の主な利点は、生きている動物の毛細胞の機能を可視化し、毛細胞のコレクションが感覚情報を検出して送信する方法を研究できることです。
この手順を開始するには、細かい鉗子とタングステンワイヤーを使用して、硬化したカプセル化剤に、頭と尾を通して幼虫を固定するために使用されるピンをファッション化します。ヘッドピンを作るためには、0.035ミリメートルタングステン線を片手に持ちます。もう一方の手で細かい鉗子を使用して、90度で端から1ミリメートル上にワイヤーを曲げます。
鉗子を細かいはさみと交換し、曲がった1ミリメートル後に切断してピンを作成します。次に、鉗子を使用して、チャンバーの硬化カプセル化にピンを挿入します。幼虫を灌流チャンバの中央に置き、シリコーンカプセル化剤に対して横に平らに置きます。
細かい鉗子を使用して、0.035ミリメートルのヘッドピンを幼虫に垂直に下ろします。眼と大蓋小胞の間にヘッドピンを挿入し、カプセル剤の中に下に挿入します。2番目の鉗子を使用して、後部および腹側に沿って幼虫を安定させ、ピン留めします。
ピンの水平部分が幼虫に接触し、カプセル剤にずっと押し込まないようにしてください。後の心臓注入および毛髪細胞イメージングを妨げないように、ピンを腹腹腔内に角度付けしたり、幼虫の前部に向いたりする。鉗子を使用して、0.025ミリメートルの尾ピンを尾の端にできるだけ近い脊索に挿入します。
幼虫にアルファブンガロトキシンを注入するには、ゲルローディングピペットチップを使用して、溶液の3マイクロリットルを注射針にバックフィルする。泡なしで、チップに均等にソリューションをロードします。次に、手動マイクロマニピュレーターに取り付けられたピペットホルダーに心臓注射針を挿入します。
ステレオ顕微鏡の下で、麻酔幼虫のAP軸に垂直に整列し、30度の角度で指し示すように針を置きます。次に、ピペットホルダーを圧力インジェクタに接続します。αブンガロトキシンのボーラスを溶液に注入し、針先がはっきりしているかどうかをテストする。
赤い色が見えない場合は、針先をピンの端に向けてゆっくりと削り、針がはっきりするまでもう一度試してください。続いて、心臓の外側の皮膚に触れるまで、針を心臓に向かって進める。針を幼虫に押し込み、心臓の前の皮膚の色素細胞のくぼみを探して、針が幼虫に対して正しい平面に配置されていることを確認します。
次に、針を後に進め、皮膚を突き刺して心臓腔に入ります。針を少し引き戻し、アルファバンガロトキシンのボーラスを心臓腔に注入します。心臓腔の膨張、または空洞に入る赤い染料を探します。
幼虫を3回軽くすすい、1ミリリットルの神経緩衝液を使用して残留MS222を除去する。流体をすべて除去しないでください。灌流チャンバ内のニューロンバッファーの約1ミリレターで幼虫を維持します。
この手順では、ゲルローディングチップを使用して適切に壊れた流体ジェット針にネロナーバッファーの10マイクロリットルをバックフィルします。泡なしで先端に均等にソリューションをロードします。次に、電動マイクロマニピュレータに取り付けられたピペットホルダーに針を挿入します。
輸液室を顕微鏡ステージの円形チャンバーアダプターに入れます。幼虫が視野の中心になるように電動ステージを動かします。続いて、円形チャンバーアダプタを回して、APが幼虫へのアクセスを流体ジェット針の軌道とほぼ一致するようにします。
透過光と差動干渉コントラストを使用して、幼虫を焦点にして10倍の目標の下に中央に置く。次に、10 倍の目標を上げます。電動マイクロマニピュレータを使用して、流体ジェットニードルを視野の中央に下ろし、透過光で照らし、ニューロンバッファにほとんど触れないようにします。
その位置を確認するために幼虫に焦点を当てるために10倍の目標を下げます。流体ジェット針の目的をフーラス。マイクロマニピュレーターを x 軸と y 軸に持つ流体ジェット針を、幼虫の後側に平行な位置に移動します。
その後、幼虫に焦点を当てます。針をZ軸に下ろし、針を魚の裏側に沿って、体から1ミリメートル離れたところに置きます。円形のチャンバーアダプターを慎重に動かして、流体ジェットニードルが幼虫のAP正中線に沿って整列していることを確認します。
次に、60倍の水の目的に切り替えます。目的がニューロンバッファーにエマースされていることを確認します。神経マストを見つけるために細かい焦点を使用してください。
続いて、モタライズされたステージを移動し、対象となる神経マストを視野の中心に配置します。魚の裏側に沿って流体ジェット針の先端を保ちます。流体ジェット針先を幼虫やチャンバー表面に触れないでください。
マイクロマニピュレーターで流体ジェット針を配置し、ニューロマストの外縁から 100 マイクロメートルになるようにします。次に、アペカルヘアバンドルの先端まで焦点を合わせます。流体ジェット針の底は、この平面に焦点を当てる必要があります。
撮像ソフトウェアからの入力を受け取るために、マニュアルから外部モードへの高速圧力クランプを設定します。ゼロボタンを押して高速圧力クランプをゼロにし、設定点ノブを使用して安静圧をわずかに正に設定します。ヘッドステージ出力に取り付けられたPSI圧力計を使用して、高速圧力クランプの安静出力を確認します。
毛束を刺激するために必要な圧力を決定するには、200〜500ミリ秒の0.125および0.25ボルト出力でテスト刺激を適用します。各試験刺激について、毛束の先端、キノビリアの偏向の距離を測定する。約5マイクロメートルの距離の束を移動する圧力を選択してください。
キノ紀の先端がずっと焦点を合わせ続けていることを確認します。単一平面画像を取得するには、フレーム30の後、3秒で80フレームの取得中に提供する刺激を選択します。メカノイ感受性カルシウムの応答を測定するには、補助毛束の基部に焦点を当て、画像取得を開始します。
シナプス前カルシウム応答を測定するには、毛細胞の基部に焦点を合わせ、画像取得を開始する。シミュレーション中にニューロマスト内でのGCaMP6S強度の時空間的変化を可視化する手順をここで概説する。時刻は、タイムスタンプに従って左から右に表示されます。
一番上の行は、70 フレームの GCaMP6S F イメージ シーケンスから 14 個の時間ビンのうち 5 つを示しています。2 行目では、ベースラインが各 GCaMP6S F ビンイメージから削除され、デルタ F イメージが作成されます。3 行目では、デルタ F イメージがグレースケールから赤いホット ルックアップ テーブルに変換されています。
一番下の行では、3 番目の行が一番上の行の F イメージに重ね付けされています。この手順を試みる際には、データからモーションアーティファクトを除外するために、原稿に記載されているように、幼虫が正しくピン留めされていることを確認し、適切なコントロールを使用することを忘れないでください。アルファブンガロトキシンを使用すると危険なことができます。
手袋を取り扱うなど、注意を要します。
