プロモーターやエンハンサーのようなシス調節要素は、遺伝子発現の重要な決定因子です。これらの要素を研究するための伝統的なアプローチは面倒であり、多くの場合、異種レポーター遺伝子の使用を伴う。ここでは、白血病細胞株におけるRUNX1イントロニックサイレンサーの転写役割を調べるためにCRISPRを用いることを実証する。
このプロトコルは、実行が簡単で、内因性遺伝子コンテキストにおける遺伝子調節機能の迅速な評価を可能にします。造血細胞は、しばしばプラスミドベースの方法でトランスフェクトすることは困難である。このプロトコルでは、エレクトロポレーションを使用して、あらかじめ組み立てられたCas9、ガイドRNA、複合体を細胞に送達します。
このアプローチの利点は、改善された編集効率と細胞生存率の使用だけでなく、ターゲットの影響を減少させました。また、その後のフラグメント分析の使用により、大量のサンプルから所望の変異クローンを簡単かつ迅速にスクリーニングできます。手順を実証することは、私の研究室の技術者であるユク・リン・ヨンです。
2つのCRISPR RNA、1つの5つの素数とターゲットシス調節要素の他の3つの素数、またはCREを設計することで始めます。NGG の PAM が Cas9 認識のターゲット シーケンスのすぐ下流に位置していることを確認します。gRNA複合体を形成するには、CRISPR RNAとトレーサーRNAを原稿の方向に従ってTEバッファに組み合わせ、44マイクロモルの最終二重濃度を求めます。
95°Cで5分間インキュベートし、室温まで冷却します。36マイクロモルの最終的なヌクレアーゼ濃度のためにPBSで組換えCas9ヌクレアーゼを希釈します。次に、希釈したヌクレアーゼの等量をgRNA二重鎖のそれぞれと混合し、室温で20分間インキュベートしてRNP複合体を形成させます。
遠心分離機 1.5ミリリットルチューブ内の 250 万細胞を 500 回 g で 5 分間.その後、上清を捨て、フェノールレッドなしでRPMI 1640培地の163マイクロリットルで細胞を再懸濁します。RNP複合体の16.7マイクロリットルと100マイクロモルエレクトロポレーションエンハンサーの3.6マイクロリットルを細胞に加え、0.2センチメートルのギャップエレクトロポレーションキュベットに混合物を移し、気泡を導入しないように注意してください。
細胞を電気ポレートし、完全なRPMI 1640培地の6ミリリットルを含むT-25組織培養フラスコに移します。5%の二酸化炭素で37°Cで細胞をインキュベートします。エレクトロポレーションの翌日、完全なRPMI 1640培地で細胞を1ミリリットル当たり5000細胞に希釈する。
そして、96ウェル組織培養プレートの各ウェルに細胞懸濁液の100マイクロリットルを追加します。7~14日間細胞を培養し、ハイスループット精製システムを用いてゲノムDNAを抽出する。96ウェル抽出プレートの各ウェルに100マイクロリットルのプレート結合および溶菌バッファーを加え、続いてPBSの10マイクロリットルで再懸濁した50,000個の細胞を加えます。
上下にピペットを入れ、ウェル内容物を混ぜます。プレートを室温で30分間インキュベートし、ゲノムDNAが井戸に結合できるようにします。その後、慎重に井戸から溶液を吸引し、洗浄バッファーの120マイクロリットルでそれらを洗浄します。
プレートを空気乾燥します。各ウェルに20マイクロリットルのPCRミックスを加え、原稿の指示に従ってPCRを実行します。増幅が完了したら、選択した数のサンプルの濃度をフルオロメーターで測定して、製品の量を推定します。
ヌクレアーゼを含まない水で、すべてのサンプルをマイクロリットル当たり0.5ナノグラムに希釈します。希釈PCR産物の1マイクロリットルを8.5マイクロリットルの脱イオンホルムアミドと0.5マイクロリットルの蛍光色素標識サイズ標準で、遺伝子分析装置と互換性のある96ウェルプラットで混合します。プレートセプタでプレートを覆い、サーモサイクラーで3分間摂氏95度でサンプルを変性させます。
キャピラリー電気泳動を行い、標識PCR産物を分離し、解析ソフトウェア上で結果を分析します。オレンジ色のアイコンをチェックして、ラベル付きフラグメントとサイズ標準を表示して、サイズの呼び出しの品質を評価します。次に、青色のアイコンをチェックして、標識された PCR 産物を表示します。
野生型および変異産物に対応するピークを特定し、変異型ピーク下の面積を野生型および変異型ピークの面積の合計で割ることによって、各サンプルの変異レベルを推定する。さらに連続的な希釈のために予想される削除の高レベルを持つ複数のセル プールを選択します。DNA抽出、蛍光PCR、キャピラリー電気泳動のステップを繰り返し、その後の分析のために95%を超える変異レベルのクローンを選択します。
選択したクローンから全RNAを抽出し、無料のDNA合成を行います。原稿の指示に従って、ポリTプライマーとdMPとRNAを混合し、摂氏65度で5分間インキュベートします。その後、少なくとも1分間氷の上に反応を置きます。
反応にcDNA合成ミックスの10マイクロリットルを追加します。その後、サーモサイクラーで50分、摂氏85度で50°Cでサンプルをインキュベートします。cDNA合成後、RNase Hの1マイクロリットルでサンプルを処理し、20分間摂氏37度でインキュベートします。
代替プロモーターから生成された個々の転写分散に特異的にプライマーおよびTaqManプローブを設計し、特定の転写配列を含むDNA断片をプラスミドDNAにクローン化する。転写物定量の標準曲線として、組換えプラスミドの10倍希釈系列を作ります。各サンプルに対して 20 マイクロリットルの PCR ミックスを準備し、原稿の指示に従ってリアルタイム PCR を実行します。
結果を分析し、ハウスキーピング遺伝子を用いて各サンプル中の標的転写物のコピー数を正規化します。このプロトコルは、RUNX1イントロニックサイレンサの削除に成功しており、毛細管ゲル電気泳動で欠失が確認されました。野生型および変異型PCR産物の予想サイズはそれぞれ約500塩基対と230塩基対である。
突然変異産物のサイズは、切断部位で形成されたインデルのためにクローン間で異なる可能性がある。削除の身元を確認するために、サンガーシーケンスが使用されました。RUNX1遺伝子には、P1とP2の3つの主要なmRNA転写産物を産生したP1とP2の2つのプロモーターが含まれており、P1によるRUNX1c、P2によるRUNX1aおよびRUNX1bが含まれています。リアルタイム定量PCRを使用して、サイレンサ要素の欠失がこれらの転写物の発現にどのように影響するかを決定することができます。
CRISPR RNAの良い設計は、実験の評価にとって重要です。CRSIPR RNAが意図した削除領域に密接にパッケージされていることを確認します。また、PAMシーケンスがCas9認識のターゲットシーケンスの下流に位置していることを確認してください。
CREの研究とは別に、この戦略は遺伝子の位置研究に使用することができ、RNA干渉の代わりに遺伝子機能を調べることができます。CRISPRは染色体の立体構造捕捉技術と組み合わせることで、癌のような様々な健康問題に関連する改変ゲノム組織および遺伝子発現におけるCREの関与を解読するのに確実に役立ちます。
