非コーディングRNAは、多くの場合、複数のアイソフォームを持っています。インビトロ過剰発現研究では、これらの表現されたアイソフォームをすべて研究することはしばしば困難である。この技術により、ゲノムから直接発現を導き出し、細胞が特定の非コードRNAに対して内在性アイソフォームを発現することを可能にする。
この強力な技術により、ユーザーは正確性と正確性を持つゲノム内の任意の遺伝子の発現を特異的に指示することができます。特定の遺伝子に対するガイドRNAを設計することにより、内因性遺伝子スプライシング機械を使用して、所定の細胞内で自然なアイソフォームを発現することができる。手順を実証することは、私の研究室のポストドクターであるロバート・ランキンです。
転写開始部位の100塩基対内に位置するガイドRNA配列を設計するには、BLATなどの遺伝データベースを使用して、ガイドRNAが対象遺伝子に固有であることを確認します。ガイドRNAと非活性化Cas9プラスミドを摂氏4度で保存します。アンピシリンとルリアスープ寒天プレートに大腸菌をストリークアウトし、摂氏37度で一晩細菌を成長させます。
翌日、コロニーを摘み取り、一晩アンピシリンでLBの5ミリリットルで細菌を増殖させ、37°Cインキュベーターでチューブを激しく振る。翌日、2リットルフラスコにアンピシリンを入したLBの200ミリリットルに2ミリリットルの細菌を加え、37°Cのインキュベーターで一晩フラスコを激しく振る。3,724回gで20分間細菌をスピンダウンし、DNA精製に進みます。
dCas9含有レンチウイルスを作成するには、最初に0.01%ポリL-リジンの5ミリリットルで100ミリリットルの組織培養皿をコーティングし、完全なダルベッコの修正イーグルスミディアムの10ミリリットルで1皿あたり500万HEK293T細胞をプレート、 次に、10マイクログラムのLTR含有ガイドRNAベクターまたはLTR含有非活性化Cas9ベクターをウイルスの成分を含むプラスミドと混合してDNAトランスフェクションサンプルを調製する。450マイクロリットルの総体積に水を加え、注射器に取り付けられた0.2ミクロンのフィルターチップを通して混合物を濾過します。次に、DNAのトランスフェクションサンプルごとに2.5モルの二塩化カルシウム50マイクロリットルを加え、穏やかに混ぜます。
シリンジに取り付けられた0.2ミクロンのフィルターチップを通してカルシウムとDNAの混合物を濾過します。ピペット500マイクロリットルの2X HBSを5ミリリットルポリスチレンチューブに。カルシウム-DNA混合物の500マイクロリットルを滴下し、穏やかに渦を加えます。
室温で3分間インキュベートします。各HEK293T含有組織培養皿にDNA-カルシウムHBS懸濁液を1ミリリットル加え、一晩で摂氏37度で5%の二酸化炭素インキュベーターにインキュベートします。3日目には、ゆっくりと皿からメディアを取り出して捨てます。
PBSで細胞を一度慎重に洗ってください。20ミリモルHEPESと10ミリモルのナトリウムブトイレートを補った完全なDMEMの6ミリリットルを追加します。その後、5%の二酸化炭素インキュベーターで5〜6時間摂氏37度で細胞をインキュベートします。
インキュベーション後、PBSで細胞を1回洗浄し、HEPESを20ミリモルHEPESで完全なDMEMを5ミリリットル加えてHEK293T細胞に加えます。5%の二酸化炭素インキュベーターで細胞を摂氏37度で12時間インキュベートする。4日目にHEK293T細胞上清を収集し、ウイルスを含む上清をフィルタリングします。
ウイルス粒子数を開始するには、まず、蒸留水の19部を加えて、P24 ELISAキットから洗浄濃縮物を希釈する。次に、このキットから200ナノグラムに希釈して、RPMI 1640を希釈剤として使用し、P24 ELISA希釈テーブルに従って1.5ミリリットルチューブの標準曲線の希釈液を作ります。サンプル内のウイルスの濃度を測定するには、サンプル希釈液を96ウェルプレートの指定ウェルに加え、1:1000希釈から始め、必要に応じて体積を変更して標準曲線の範囲内に収まるようにします。
その後、トリトンX-100でサンプルを0.5%の最終濃度に希釈し、各サンプルとRPMI 1640の200マイクロリットルを指定されたウェルに加えます。プレートを密封し、摂氏37度で2時間インキュベートします。1X洗浄バッファーのウェルあたり300マイクロリットルでプレートを6回洗います。
プレートを反転し、ペーパータオルでタップして余分な液体を取り除きます。次に、キットから100マイクロリットルの検出器抗体を、基板ブランク以外のすべてのウェルに追加します。プレートを密封し、摂氏37度で1時間インキュベートします。
プレートを洗い、余分な液体を取り除きます。検出器抗体を測定するために、ストレプトアビジン・ワサビペルオキシダーゼをSA-HRP希釈液で1:100希釈で希釈する。希釈したSA-HRPを十分に混ぜ、ブランクを除くすべてのウェルに100マイクロリットルを加えます。
プレートを密封し、室温で30分間インキュベートします。次に、1X洗浄バッファーでプレートを洗浄し、余分な液体をタップします。1つのプレートに十分な基板溶液を作るために、11ミリリットルの基板希釈液にオルソフェニレンジアミン錠剤を1つ落とします。
OPD溶液を精力的に渦液にして完全に溶解し、光から保護します。ブランクを含むすべてのウェルにOPD基質溶液の100マイクロリットルを加えます。分光光度計を用いて、450ナノメートルで吸光度を直ちに読み取る。
1秒間隔で10回繰り返し、平均測定を行います。再懸濁培養を行い、T75フラスコ内のジュルカットT細胞をポリブレンを用いた血清培地の5ミリリットルに100万個の密度を有する。その後、100万個のdCas9含有ウイルス粒子を含むHEK293Tコンディショネド培地を追加します。
5%の二酸化炭素で37°Cで細胞をインキュベートします。感染後3日間、233時間gで細胞を5分間スピンダウンし、ピューロマイシンを補充した完全なDMEMの10ミリリットルでそれらを再中断する。T75フラスコで細胞を培養し、5%の二酸化炭素で摂氏37度で培養します。
9日間の3日ごとに、5分間233回gで細胞をスピンダウンし、ピューロマイシンを補充した完全なDMEMで培地を置き換えます。ヘモサイトメーターまたは自動セルカウンターを使用して細胞を数えます。次いで、培養処理組織を有する96ウェルプレート上に、第1ウェルでピューロマイシンを添加した完全なDMEMの100マイクロリットルに10,000個の細胞を加える。
ピューロマイシンを補充した完全なDMEMで、以下のウェルの内容物の1:1シリアル希釈を行います。5%の二酸化炭素で37°Cで細胞をインキュベートします。クローン細胞を2つの24ウェルプレートに拡大し、3つのクローンの6ウェルプレートのウェルあたり200万個の細胞をプレートします。
他の3つの井戸に非形化されたユルカット細胞をコントロールとしてプレートします。最後に、細胞をT75フラスコにプレートし、細胞を細胞培養インキュベーターに一晩入れます。定量的PCRを開始して遺伝子発現を測定するには、まずRNAのマイクログラム1マイクログラム、cDNA合成バッファー4マイクロリットル、逆転写酵素1マイクロリットルを250マイクロリットルチューブに加えて相補DNAを合成し、次に20マイクロリットルの最終体積に水を加えます。
その後、サーマルサイクラーを摂氏42度で30分間、摂氏95度で5分間使用して逆転写酵素を不活性化します。合成後、60マイクロリットルの水でcDNAを希釈します。各前方および逆プライマーの0.5マイクロリットルを含むチューブに対してポリメラーゼ連鎖反応を実行し、最終的な濃度は10マイクロモル、5マイクロリットルのSYBRグリーン、4マイクロリットルのcDNAを使用します。
最後に、10日間ハイグロマイシンBを補充DMEMのジュルカットdCas9細胞を選択します。細胞をスピンダウンし、3日ごとにメディアを変更します。RNAse を精製し、RT-qPCR に進みます。
本研究では、転写開始部位から離れた10〜100塩基対内にあったgRNA配列を、炎症性腸疾患に関連する長い非コードRNAであるIFNG-AS1の転写軌跡にCas9活性化複合体を導くために使用された。二重導入細胞の選択を可能にするために、2プラスミド系を使用して、dCas9またはgRNAEエンハンサーのいずれかを細胞に入れ移した。ここでMS2タンパク質はIFNG-AS1の過剰発現を増強する。
Cas9の発現は両方のクローンについて確認された。HPRT1に対するプライマーを用い、非導入細胞中のRNAの存在を確認した。cDNA反応から逆転写酵素を省略することによりmRNA発現を確認した。
IFNG-AS1の3つのスプライス変異体は、全ての既知のIFNG-AS1転写物に対して、転写特異的なプライマーセットまたはプライマーセットのいずれかで検出できる。すべての蛍光曲線は指数関数的であり、ハウスキーピング遺伝子HPRT1は、制御細胞とIFNG-AS1 gRNA発現細胞の間の半サイクル内で指数位相に達した。すべての既知のIFNG-AS1転写物に対するプライマーは、IFNG-AS1発現の20倍の増加の測定で、実験の間に最も検出可能であった。
しかし、IFNG-AS1の第3転写産物は、IFNG-AS1レベルの5〜10倍有意な増加を示した。目的の遺伝子を積極的に過剰発現させるためには、ステップ2.1のガイドRNAの設計は、プロトコルの成功にとって非常に重要です。さらに、高品質のウイルス粒子の製造は、プロトコルコンポーネントの堅牢な表現を保証します。
所望の遺伝子が過剰発現すると、機能性の研究が行われ、遺伝子機構を調査することができる。我々の例では、関心のある遺伝子の過剰発現に続くサイトカイン産生を見ることを選んだ。この技術は、2013年にグリースバッハグループによって開発され、他のグループによって広く適用され、詳述されています。
私たちは、この技術を長い非コード化RNAに適用して、その特定の機能を探求することに興奮しました。複製不良レンチウイルスは、ウイルスの作業のために承認された実験室で処理する必要があります。さらに、ヒト細胞株および大腸菌は、生体有害性と考えられている。
最後に、組換えDNAプラスミドは訓練を受けたスタッフによって処理されるべきです。
